中国农业大学本科生“URP”计划立项申请书

　中国农业大学 本科生“URP” 计划立项申请书

　项目名称 瓜 利用酵母双杂交技术验证黄瓜 CsHD8 蛋白的 自互作关系

　申 申 请 人

　 刘兴旺

　 副 副 教授

　工作单位

　园艺学院蔬菜系

　电子信箱

　联系电话

　填表日期

　 2019.12.09

　 中国农业大学教务处制

　项目名称 利用酵母双杂交技术验证黄瓜 CsHD8 蛋白的自互作关系 项目起止时间 2020.3-2021.3 项目申请人情况 姓名 刘兴旺 性别 男 出生日期 1983-05 最后学历与学位 博士 专业技术职务 副教授 从事专业 蔬菜学

　1.1 项目概况 黄瓜是一种受消费者喜欢的鲜食蔬菜。其外观商品性状犹如现代人“颜值审美”一样重要。因此，与黄瓜“颜值”相关的一些性状，如果皮是否光滑，是否具有光泽等性状使得育种家对此十分关注。

　黄瓜以嫩果为产品，外观光鲜、油亮的果实深受消费者的喜爱，同时也是国内外黄瓜育种的重要目标性状（Yang et al., 2014; Chen et al., 2016）。从育种角度来讲，果实油亮往往与植物的蜡质有关。以近年来我国黄瓜新品种推广与应用情况看，果皮蜡质性状在某种程度上已成为决定某个品种是否具有生产应用潜力的关键性状之一(Liu et al., 2016)。因此，果皮蜡质性状对于黄瓜品种选育和高效优质生产具有重大意义。然而，由于试验材料、果皮性状调查困难等因素的限制，目前人们对黄瓜果实的表皮蜡质发育的关键基因挖掘及转录调控网络却还知之甚少。因此非常有必要进行新的转录因子或者重要转录因子的挖掘。课题组通过种种手段，克隆出一个与亮度相关的转录因子 CsHD8，但 但 CsHD8 基因对亮度 在蛋白水平上 调控机制 尚不 清晰。

　在蛋白的功能研究中，酵母双杂交技术是一种十分重要的验证手段。它是研究蛋白之间相互作用的主要方法之一，其原理是通过非共价键将两个或两个以上的蛋白质分子形成复合物的过程（Li et al., 2011）。整个酵母双杂交系统由 DNA 结合域(DNA-BD)和转录激活域(AD)构成。当上述 BD 和 AD 结构域在空间上相互接近时，才能激活报告基因的转录。利用此技术可以研究植物、微生物以及动物体内蛋白自身互作及与其它蛋白互作的情况，在一定程度上能解析蛋白层次调控的机制。

　1.2 本项目主要解决基本问题：利用酵母双杂交技术验证 CsHD8 是否存在自身互作关系？

　二、实施计划及方案(明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法) 2.1 文献查找与阅读 项目参加者首先阅读本课题组近年来发表的相关文章，同时学会引用关键词以及相关技术搜索到相关文献并进行文献阅读，分析文章的思路并根据项目撰写试验方案。

　考核办法：学生根据项目研究目的自拟一份实验方案及技术路线交给指导教师，由老师考核评分。

　2.2 实验方案 1. 诱饵蛋白表达载体的构建 根据 CsHD8 基因的 ORF 设计带有 NdeI 酶切位点的引物，以 CsHD8 的 CDs 为模板，PCR扩增目的序列。PCR 产物经过 1%的琼脂糖凝胶电泳后回收，将胶回收的产物和酵母表达载体 pGBKT7 分别经过 NdeI 酶切后，用 T4 DNA 连接酶连接，构建重组表达载体 pGBKT7，将其转化到 DH5α 感受态细胞中。进行菌液 PCR，筛选阳性克隆送测序验证。

　2. 验证重组质粒在酵母细胞中的表达 采用做好的Y2HGold酵母感受态，将测序无误的重组质粒pGBKT7-CsATAF1转入Y2HGold酵母菌，涂布于 SD/-Trp 固体平板，30 ℃恒温箱倒置培养 2-3 d。待平板上长出菌落，挑取单菌落划线至新的 SD/-Trp 固体平板，对划线菌编号标记，待长出后进行菌落 PCR。

　3. 酵母杂交 将以构建好的 pGBKT7-CsHD8 和 pGADT7-HD8 共转入 Y2HGold 菌株中，涂于QDO(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade) +X-α-gal 的培养基上。28℃培养 3 d。为排除假阳性和多种质粒融合现象，将蓝色克隆在 QDO/X/A 上反复筛选至少 3 次。

　2.3. 撰写结题报告

　 所有参与本项目的学生合作完成一份结题报告，由指导教师点评，并最终上交；同时，完成结题 PPT，分章节分配给各学生讲述。

　 能力培养：通过本部分，对学生科研论文撰写与讲述能力进行培养，提高学生动手、动脑与口头表达能力。

　 考核指标：结题报告一份，PPT 一份。

　三、实施基础和条件 申请人有从事黄瓜果实发育分子机制研究的基础，可以完成对本项目所涉及试验的指导和学生培养。申请人实验室构建了良好的黄瓜果刺材料和果刺发育生理过程知识体系，可以为本研究提供最合适的材料和试验环境。申请人所在实验室和学院开放平台拥有包括常规 PCR 仪、凝胶检测系统、Real-time PCR 和生物信息分析服务器在内的生理、生化、分子生物学和生物信息学分析仪器与设备，可以完全支持本研究涉及的所有试验。另外，申

　请人所在实验室有完备的日光温室可以为本研究所需试材提供面积充足且条件良好的种植场所。

　四、学生提交的成果 1、提交相关研究报告 1 份； 2、提交试验过程与结果的相关图片及数据资料 1 份； 3、提交 PPT 汇报材料，并完成验收。

　五、经费预算 经费预算总额 4,000 元。

　5.1 试剂与材料费：3,000 元。包括限制性核酸内切酶，连接酶，大肠杆菌感受态，LB培养基等试验材料，购买 PCR 管、离心管等。

　 5.2 测试费：1000 元，主要开展序列测定。

　六、学院 URP 领导小组意见

　 签字 （盖章）

　 年

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　指导教师意见(应明确签署“同意接收”或“不同意接收”)

　 指导教师签字

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