【PPARγ激动剂对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1和Smad信号途径的作用研究】人增生瘢痕成纤维细胞

　　增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。目前已知,转化生长因子(TGF)β1是主要致纤维化因子之一, Smad是参与TGF-β主要信号转导途径, Smad2和Smad3磷酸化参与其信号转导。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)系一类配体激活的核转录因子超家族,受到配体或激动剂的激活而活化,参与许多细胞功能的调控[1-3]目前有关其对瘢痕成纤维细胞作用机制的研究尚少。本文通过研究PPARγ激动剂对TGF-β1致瘢痕成纤维细胞作用的影响及机制,初步探讨PPARγ激动剂抗瘢痕形成的潜在作用。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 取材标准：①增生性瘢痕，瘢痕色泽红，质硬，高出皮肤表面，均为烧伤创面愈合已超过3个月，但瘢痕仍持续增生，瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾治疗；②患者无其他疾病。
　　1.1.2 增生性瘢痕成纤维细胞：采用组织块法进行原代培养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1mm左右的组织块置于培养瓶中，在95%空气、5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6～8h，使组织块牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3～4天换液1次，2～3周后，原代细胞生长成单层，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养，实验用第3～5代细胞。
　　1.1.3 主要试剂:DMEM细胞培养液和胰蛋白酶(美国GIBCO公司),人类重组TGF-β1(美国Pepro Tech EC Ltd公司), PPARγ配体15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮(美国Biomol公司),Trizol提取液(美国GIBCO/BRL公司),逆转录试剂盒(立陶宛Fermentas公司),山羊抗大鼠Smad2、Smad3、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗大鼠FN多克隆抗体(美国GIBCO公司),辣根过氧化物酶标记IgG二抗(美国KPL公司),PCR引物(上海生工合成)。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养与刺激: 第3～5代细胞瘢痕成纤维细胞株培养于含10%灭活小牛血清的DMEM/F12培养液中,置37℃, 5% CO2培养箱中,按1×106接种于25cm2培养瓶中,待细胞生长至80%融合状态,无血清DMEM/F12培养液孵育24h,使细胞生长同步化。分别加入不同浓度的TGF-β1(0、1、2、5和10ng/ml)培养24 h,或加入5ng/ml TGF-β1分别培养0、6、12和24h后收集细胞。同法进行细胞培养,分别应用10μmol/L 15d-PGJ2、10μmol/L曲格列酮、10μmol/L齐格列酮预处理2h,再加入5ng/ml TGF-β1处理,另设一空白对照组和5ng/ml TGF-β1组,作用24 h后收集细胞。对照组和各处理组均重复3次。
　　1.2.2 RT-PCR检测瘢痕成纤维细胞细胞FN mRNA的表达:以Trizol法提取上述收获的细胞总RNA,按逆转录试剂盒操作说明将RNA逆转录为cDNA,进行PCR扩增。FN上游引物: 5"TTATGACGATGGGAAGACCTA3";下游引物: 5"GTGGGGCTGG AAAGATTACTC3";β-肌动蛋白上游引物: 5"TGGAGAAGAGCTAT GAGCTGCCTG3";下游引物: 5"GTGCCACCAGACAGCACTGTGTTG3"。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,用计算机凝胶成像分析系统进行吸光度扫描分析,以β-肌动蛋白吸光度值(A)进行校正。
　　1.2.3 Western印迹检测瘢痕成纤维细胞细胞FN蛋白的表达:刺激细胞结束时,加细胞裂解液,4℃, 12 000r/min离心10min,上清液中的蛋白浓度以二喹啉甲酸(BCA)法测定。取等量蛋白与5×上样缓冲液混合煮沸5 min后进行凝胶电泳。电泳后进行Western印迹检测FN蛋白表达。
　　1.2.4 Western印迹检测瘢痕成纤维细胞细胞Smad及酸化Smad蛋白:同上方法培养细胞,以1×105接于六孔板中,加入5 ng/ml TGF-β1分别培养0、1min、30min、1h和2h后收获细胞,提取总蛋白,处理分组:对照组, 2ng/ml TGF-β1组, 5ng/ml TGF-β1组, 10μmol/L 15d-PGJ2＋5ng/ml TGF-β1组, 10μmol/L曲格列酮＋ng/ml TGF-β1组, 10μmol/L齐格列酮＋5 ng/ml TGF-β1组(3种药物分别预处理2h)。作用24h收获细胞,提取总蛋白。Western印迹检测蛋白表达。
　　1.2.5 统计学处理:应用SAS6.12统计软件处理数据。RT-PCR和Western印迹实验重复3次, PCR产物和蛋白印迹显影图片光密度扫描比值以x±s表示,各组间均数比较采用方差分析。
　　
　　2结果
　　2.1 TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞细胞FN mRNA表达的剂量效应和时间效应: 瘢痕成纤维细胞细胞有基础量FN mRNA表达。经不同浓度TGF-β1刺激24 h后, FN mRNA表达量明显增加,呈一定剂量范围内(0～5ng/ml)的依赖效应。1ng/mlTGF-β1刺激时, FN mRNA表达量即明显增加(P0.05)。
　　瘢痕成纤维细胞细胞有基础量FN蛋白表达, 2ng/ml TGF-β1能诱导FN蛋白表达增加(P0.05)。
　　2.3 TGF-β1对瘢痕成纤维细胞细胞Smad信号蛋白表达的影响:基础状态下瘢痕成纤维细胞细胞有少量p-Smad2/3蛋白表达, TGF-β1刺激15 min后, p-Smad2/3蛋白表达量开始上升,在1h时达到高峰, 2h后开始有所下降,总Smad2和Smad3蛋白表达量无变化。
　　2.4PPARγ激动剂对TGF-β1/Smads蛋白表达的影响与对照组比较, 2ng/ml TGF-β1和5ng/ml TGF-β1均能诱导p-Smad2/3蛋白表达量上升(P0.05)。各组间总Smad2和Smad3蛋白表达量无明显变化。
　　
　　3讨论
　　3.1 TGF-β表达升高常常与瘢痕增生密切相关,影响瘢痕成纤维细胞表达、增殖和调亡 [1-3]。由于TGF-β本身有许多生理作用,单纯抑制TGF-β表达/活化或阻断其与受体结合会产生许多生物学负效应。以其下游因子或过度活化的信号通路蛋白为靶目标,寻找更好的治疗手段就成为延缓瘢痕硬化进展的研究热点之一。
　　3.2PPARγ日益成为研究治疗纤维化疾病如肾小球硬化、心脏间质纤维化、动脉粥样硬化和急性肺损伤的靶目标[3-6]。15d-PGJ2是其天然配体,噻唑烷二酮类(TZD) (如曲格列酮和齐格列酮等)是其激动剂。我们以往的研究表明, PPARγ可降低瘢痕内Ⅰ型胶原的含量[7]，可以抑制瘢痕成纤维细胞增殖,促进其凋亡[8],但有关PPARγ及其激动剂对FN合成的影响研究尚少。本研究发现, 15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮均能减少TGF-β1诱导的FN的合成,表明PPARγ的激活通过抑制TGF-β1诱导的瘢痕成纤维细胞ECM的合成,具有抗瘢痕成纤维细胞纤维化的作用。不同的PPARγ配体或激动剂在不同的细胞中作用机制各异,而且有非依赖PPARγ途径参与其中。Baoling等[9]研究发现,匹格列酮和15d-PGJ2均能抑制TGF-β1诱导的FN表达,匹格列酮完全通过激活PPARγ实现其作用, 15d-PGJ2则有非依赖激活PPARγ的途径参与其中。不同的PPARγ激动剂在某些方面作用不同甚至相反。但本研究发现,各药物干预组之间相比, FN表达量差异无统计学意义,这提示三者在抗TGF-β1致纤维化作用方面,表现为相似的效果。
　　3.3 磷酸化Smad2和Smad3(p-Smad2/3)是TGF-β主要信号传导途径,参与TGF-β诸多生物学作用,如调控细胞增殖、炎症反应和致纤维化作用等,是TGF-β诱导上皮细胞转分化、ECM和结缔组织生长因子表达所必需[10]。本研究发现,TGF-β1以时间依赖方式诱导p-Smad2/3蛋白表达,提示TGF-β1可诱导瘢痕成纤维细胞Smad2/3磷酸化,参与其致纤维化过程。15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮均能降低TGF-β1诱导的p-Smad2/3蛋白表达,总Smad2和Smad3蛋白表达量无显著变化,提示PPARγ激动剂可能通过影响Smad2/3磷酸化,抑制TGF-β1致纤维化作用,且3种药物对TGF-β1诱导的Smad2/3磷酸化的抑制作用差异无统计学意义。PPARγ激动剂可能通过影响TGF-β1/Smad信号通路,拮抗TGF-β1致瘢痕作用,提示PPARγ激动剂在抗增生性瘢痕方面具有潜在的应用前景,可能成为延缓增生性瘢痕进展的治疗新手段之一。
　　
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　　[收稿日期]2011-04-10 [修回日期]2011-06-09
　　编辑/张惠娟