ＲＧＤ多肽表面修饰生物陶瓷修复骨缺损ＢＭＰ－２的表达_多肽修饰

　　[商要]目的：了解精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp,RGD)多肽表面修饰的羟基磷灰石－磷酸三钙(hydroxyapatite－tricalciumphosphate，HA－TCP)修复节段性骨缺损局部骨形态发生蛋白－2(bone morphogenet ic protcin－2，BMP－2)的表达。方法：以骨髓基质干细胞(marrow stromal cells，MSCs)复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP或单纯材料培养制备组织工程骨，选择60只新西兰白兔，制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型，实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入MSCs复合HA－TCP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA－TCP；D组：骨缺损区植入HA－TCP。术后4周取材，行修复区局部BMP－2免疫组化分析。结果：术后4周各组骨缺损区均有新骨生成，修复区局部BMP－2表达水平依次为：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)。结论：RGD多肽表面修饰对以HA－TCP为支架材料组织工程骨的修复作用有明显优化作用。
　　[关键词]组织工程；表面修饰；骨髓基质干细胞；骨形态发生蛋白
　　[中图分类号]Q813.1　[文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0737－03
　　
　　RGD多肽是介导种子细胞与支架材料粘附的多肽链，RGD序列可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面自发形成一分子层，为与受体介导的种子细胞提供特异性位点而促进细胞的粘附和分化。本研究旨在应用RGD多肽对HA－TCP材料进行表面修饰处理，以促进MSCs在其表面的粘附和生长，为骨组织工程提供一种支架材料的表面修饰手段。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　材料准备：HA－TCP双相多孔生物陶瓷(四川大学生物材料工程研究中心)含60％HA和40％TCP，孔隙率为50％～70％，孔隙直径为200～500μm。将材料修整为1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，蒸馏水加压反复冲洗，去离子水超声清洗2次，每次30min，高压蒸汽灭菌后备用。将RGD多肽(美国Peptide生物工程公司)溶解于50％乙醇中，浓度为2mmol/L。将材料分别置于带胶皮塞的离心管中，加入RGD多肽溶液，负压抽吸使RGD多肽溶液进入材料孔隙内，4℃放置24h，吸除溶液，晾干。用pH值为7.4的0.01mol/L PBS漂洗至中性，晾干。
　　
　　1．2　组织工程骨制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1800r/min离心10min，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106/ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0.25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含1×10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C和1×10-2mol/L β－磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液，每个支架材料以1×106/ml密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％CO2饱和湿度培养7天。
　　
　　1．3　动物模型和实验分组：选择3周龄雌性新西兰白兔60只，体重为2.0～2.5kg。动物全身麻醉后，常规消毒双上肢，沿上肢前外侧做纵行切口，长25mm，逐层切开、分离、显露桡骨，于桡骨中上1/3交界处截骨，去除桡骨和骨膜，制造15mm长的右侧肢体桡骨节段性骨缺损模型。实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，每组实验动物10只，其中A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入MSCs复合HA－TCP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA－TCP；D组：骨缺损区植入HA－TCP。
　　
　　1．4　BMP－2免疫组化检测：术后4周标本经4％多聚甲醛固定1周，用10％的EDTA脱钙6周，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，制作厚度为5μm的切片，裱片于APES处理的载玻片上。石蜡切片脱蜡至水，3％tt202浸泡，避光20min，蒸馏水冲洗3min×3次。胃蛋白酶消化37℃15min，PBS冲洗5min×2次，1:20羊血清封闭37℃ 30min。甩去多余血清，加一抗37℃1～2h，PBS冲洗5min×2次。1:200二抗37℃40min，PBS冲洗5min×2次。SP(1:200)37℃30min，PBS冲洗5min×2次。DAB显色，镜下控制显色时间，自来水中止显色。自来水充分冲洗，复染，封片。阴性对照以PBS代替一抗。各实验组随机选取6张切片，40×40视野下，每张切片随机取10个视野，用医用图像分析仪测量骨缺损修复区域内BMP－2免疫组化显色的平均深度(灰度值)。
　　
　　1．5　统计学方法：采用SPSS 10.0软件包对检查结果行多个样本均数的方差分析和两两比较的q检验，P＜0.05为有统计学意义。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　BMP－2免疫组化观察：BMP－2免疫组化检测结果显示，术后4周新生软骨及骨痂内呈阳性反应，阳性物质为棕黄色细颗粒，分布于间充质细胞、成软骨细胞和成骨细胞内。结果提示，各实验组骨缺损修复的过程中，BMP－2在间充质细胞、成软骨细胞和成骨细胞中表达，以PBS代替一抗的阴性对照中细胞内未见阳性信号。A组术后4周，BMP－2在材料周围和内部出现的成软骨细胞和成骨细胞中高表达，呈阳性反应的新生骨组织贯穿材料。B组术后4周，BMP－2在材料周围和内部的成软骨细胞和成骨细胞中表达，阳性反应的新生骨组织贯穿移植材料。C组术后4周，BMP－2在材料周围的成软骨细胞和成骨细胞中表达，桥接移植材料和宿主骨的新生骨呈阳性反应。D组术后4周，BMP－2在材料周围的成软骨细胞和成骨细胞中表达，材料周围形成大量新生骨呈阳性反应。靠近界面端呈阳性反应的成骨细胞较多，远离界面部位较少(图1)。
　　
　　
　　2．2　BMP－2免疫组化结果分析：术后4周各组骨缺损区均有新骨生成，骨缺损修复区BMP－2表达水平依次为：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)(表1)。
　　
　　3　讨论
　　
　　种子细胞与支架材料粘附能力的大小与细胞和材料表面的物理和化学性质有关。由两者表面物理性质所决定的粘附作用称为非特异性粘附；如果粘附涉及两者表面分子之间的相互作用，则称为特异性粘附，或称为细胞识别。细胞与材料的粘附不仅取决于细胞的表面性质，而且与细胞内部结构和功能变化密切相关。细胞与材料的非特异性粘附包括静电斥力、范得瓦耳斯力和立体结构稳定性产生的斥力等。细胞与材料的特异性粘附包括钙粘附蛋白、固有粘附蛋白和Ig超家族粘附分子等。细胞与材料表面粘附的位点称为粘附斑(adhensionplaques)，这种接触是～种紧密连接，细胞膜与材料表面的距离为10～15nm。支架材料对细胞的粘附主要通过特异性受体一整合素(integrin)发挥作用，整合素是由a、β两个亚基组成的跨膜受体。已知有14个a亚基和8个β亚基，a、β亚基的外区构成受体与特异性配体的结合，最常见的配体位点是ROD序列。整合素一方面介导细胞与细胞间及细胞与细胞外基质的粘附，另一方面具有传递信号的功能，联系细胞内外的代谢活动，对细胞的生长代谢起重要作用。成骨细胞可分泌Ⅰ型胶原、骨钙素、骨结合素、骨桥蛋白、纤维连接蛋白和生长因子等。这些蛋白中均含有RGD序列，它可被细胞膜表面的整合素受体特异性识别，激活细胞内的蛋白酶、蛋白激酶、磷酸酶等信号传导系统，促使细胞发生一系列生理和生化反应，铺展而粘附于材料表面。成骨细胞可表达al、a2、a3、a4、a5、a6、β1、β3等亚基，a5 β1为纤维连接蛋白受体，识别纤维连接蛋白的RGD序列。Shin等证实纤维连接蛋白a5 β1的抗体，以及与纤维连接蛋白竞争a5 β1的短肽ROD可抑制成骨细胞的钙化，说明纤维连接蛋白与受体a5 β1的相互作用是成骨细胞钙化成骨的先决条件。
　　骨缺损修复的关键是细胞活化和成骨信号释放，而BMP正是促使间充质细胞向骨细胞分化最初的信号分子。BMP在骨修复过程中以自分泌或/和旁分泌的方式发挥作用。具体的作用方式为：骨修复早期在创伤等因素刺激下，骨折端局部骨膜中成骨细胞和周围间充质细胞增殖，局部BMP高表达细胞增多；BMPmRNA转录功能增强，从而使BMP合成和分泌增加；局部BMP浓度增高又进一步促使间充质细胞向成软骨细胞和成骨细胞转化，并刺激上述3种细胞增殖，使局部BMP高表达细胞进一步增多，形成正反馈调节，进而使局部BMP的浓度在短期内迅速增高。骨修复晚期，随着成熟骨细胞增多，成软骨细胞、成骨细胞和间充质细胞减少，BMPmRNA转录水平下降，BMP合成减少，骨诱导作用减弱，直至达到维持正常骨代谢的平衡水平。HA－TCP双相多孔生物陶瓷是骨组织工程应用较为广泛的化学合成支架材料，但多孔块状的HA－TCP存在材料表面的亲水性差、表面自由能低、缺乏细胞识别和吸附位点等缺点，易使接种细胞流失，不利于接种细胞的粘附和生长，直接影响组织或器官的组织工程化研究。通过在材料表面固定氨基酸、多肽、蛋白质、粘附因子来改善材料表面的亲和性，可进一步优化组织工程支架材料的粘附性能。我们的研究表明，RGD多肽表面修饰的HA－TCP材料的细胞相容性明显优于单纯材料，RGD多肽修饰的材料可黏附较多的MSCs在其表面和孔隙内生长、分化和增殖，ROD多肽表面修饰对以HA－TCP为支架材料组织工程骨的修复作用有明显优化作用。