脸上色素斑 [清斑胶囊对ICR鼠皮肤色素生成及抗氧化作用的实验研究]

　　[摘要]目的：探讨清斑胶囊对黄体酮诱导的孕期全身色素加深小鼠血液和肝脏中的SOD、MDA、GSH的影响，以及对小鼠皮肤组织黑色素的影响。方法：制备黄体酮体内注射诱导小鼠全身色素加深模型，给药治疗后采用SOD、MDA、GSH试剂盒检测血清和肝脏中相关指标的变化；体外观察清斑胶囊对酪氨酸酶活性影响；免疫组化法观察对小鼠皮肤组织黑色素的影响。结果：清斑胶囊低中高三剂量组可以明显提高SOD、GSH活力，降低MDA含量；体外实验表明，清斑胶囊明显抑制酪氨酸酶活性，有效抑制皮肤组织黑色素的形成。结论：清斑胶囊具有良好的抗氧化作用及抑制小鼠皮肤黑素生成的作用。
　　[关键词]清斑胶囊；黄褐斑；抗氧化；黑色素
　　[中图分类号]Q591R332[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）10-1569-03
　　
　　Experimental research of Qing-ban cupsule on the pigment formation of ICR mouse and the ablity of anti-oxidation
　　HUANG Kai-fei1,2,WANG Mei-lan1,YANG Hui1,ZHANG Guo-dong1,XU Guang-hui1,HUANG Yi-qi1
　　（1.Xiamen Medicine Research Institute,Xiamen 361008,Fujian,China；2.Institute of Molecular Medicine,Huaqiao University,Quanzhou362021,Fujian,China）
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of SOD,MDA,GSH in blood and liver on pigments-enhanced model induced by progesterone, as well as the impact of mouse skin melanoma after treated with Qing-ban cupsule.MethodsPrepare pigments-enhanced mice model induced by progesterone in vitro.SOD,MDA,GSH were detected by kit in serum and liver after drug treatment.The effects on tyrosinase activity were observed after drug treatment. Immuno-histochemistry was used to observe the effects of melanin in mouse skin tissue after drug treatment.Results Qing-ban capsule could significantly improve the SOD,GSH activity and decrease MDA content. In vitro experiment showed that the capsule significantly improved the activity of tyrosinase, inhibited the formation of melanin in skin tissue.ConclusionQing-ban capsule had good anti-oxidation activity and good treatment on skin melanogenesis.
　　Key words:Qing-ban capsule; chloasma; anti-oxidation; melanin
　　
　　黄褐斑是一种发生于面部的慢性难治性色素沉着性皮肤病。虽然针对该病的研究较多，但对其发病原因和病变机制的研究至今未取得实质性进展，且缺乏理想的疗法[1]。寻找更为有效的、低毒的祛斑药物成为广大科研工作者迫切的任务，中医美容学以传统医学理论为指导，采用多种多样的方法，在数千年间积累了丰富而宝贵的经验[2]。
　　清斑胶囊是本所自行研制的以大豆异黄酮、VC、VE、白芷、川芎、当归为主要原料的复方制剂。为探讨其抗黄褐斑作用机理，本研究以黄体酮攻击小鼠为实验动物模型，观察清斑胶囊抗氧化作用与治疗色素沉着之间的关系。
　　
　　1材料
　　1.1动物：小白鼠（Institute of Cancer Research，ICR），雌性，购自厦门大学实验动物中心。
　　1.2仪器：UV-2501PC紫外分光光度计（日本岛津）；MK3自动酶标分析仪（芬兰Multiskan公司）；BL310电子天平（德国Sartorias公司）；CM1900切片机（德国 leica），正置显微镜(日本Olympus公司)。
　　1.3药品与试剂：大豆异黄酮、VE、VC等购自郑州荔诺生物科技有限公司；白芷、川芎、当归购自厦门鹭燕医药公司；SOD、MDA、GSH-PX试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；酪氨酸酶、多巴（Sigma公司）；鼠抗人单克隆抗体HMB45、DAB、酶标羊抗鼠二抗(福建迈新生物科技有限公司)。
　　
　　2方法
　　2.1实验动物分组：将筛选合格的小鼠随机分成5组，每组10只：①A组：空白对照组；②B组：模型对照组；③C组：治疗低剂量组（60kg质量人单位剂量的5倍）；④D组：治疗中剂量组（60kg质量人单位剂量的10倍）；⑤E组：治疗高剂量组（60kg质量人单位剂量的20倍）。
　　2.2动物模型制备：采用雌激素全身攻击法[3]，20 mg・kg-1黄体酮注射雌性小鼠大腿根部，每日一次，每周六次两侧交替，共30天。本研究采用边造模边灌胃给药，观察清斑胶囊对黄褐斑的预防作用。
　　2.3 给药方法：给药均为灌胃方式。A、B两组动物给予生理盐水；C、D、E组实验动物分别给予相应浓度的复方制剂，将以上每种组分进行灌胃治疗4周。
　　2.4 SOD、MDA、GSH的检测：小鼠眼球采血后离心制备血清，取小鼠肝脏剪碎、倒入匀浆器制备肝匀浆，用生理盐水溶解后4000r・min-1的速度离心10min，取上清液，按SOD、MDA、GSH试剂盒说明书严格操作，对小鼠血清和肝脏进行相关指标测定。
　　2.5形态学观察：取小鼠皮肤组织标本1.0cm×1.0cm，固定后的皮肤组织进行石蜡包埋后，切成4μm厚的石蜡切片，采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复后，置室温冷却。滴加50～100ml工作液于组织上，4 ℃过夜。PBS冲洗切片，将切片置于PBS缓冲液中，浸泡5min，3 次，取出切片，滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1% BSA-PBS稀释），室温孵育30min。用PBS冲洗切片。将切片置于PBS缓冲液中，浸泡5min，3次，取出切片，滴加预备好的显色剂DAB工作液60ml，室温孵育5～20min，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。正常小鼠作为阴性对照，模型组小鼠作为阳性对照，染色好的切片于显微镜下观察、拍照。
　　2.6酪氨酸酶活性测定方法：采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性。反应混合物2ml：0.1mol・L-1、pH6.5 、PBS 1.9ml+药物0.1ml(质量浓度0.1g・ml-1）。37℃孵育10min，加0.15% DL-多巴1ml，充分反应后，用分光光度计测定吸光度（A475）值。以PBS液为空白，不加药物的反应组为对照，实验每一浓度设3个复管，实验重复3次，取平均值，分别测定酪氨酸酶活性。
　　2.7统计学处理：统计结果以x±s表示，用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据两两比较采用t检验，多组之间比较用ANOVA进行。
　　
　　3结果
　　3.1 清斑胶囊对黄体酮诱导的皮肤色素沉着模型小鼠血清和肝脏中SOD、MDA、GSH含量的影响：小鼠模型组血清中SOD、GSH活性明显降低、MDA增加，低、中、高三个剂量组分别给药后，与模型对照组相比，给药组均表现出明显改善作用，其中中、高剂量组与模型组比较差异显著（P＜0.05），且具有剂量依赖效应（见表1），同时清斑胶囊可以明显升高小鼠肝脏的SOD，降低MDA水平，具有显著性差异（见表2）。
　　3.2 清斑胶囊对皮肤色素沉着模型小鼠皮肤黑色素的影响：正常对照组表皮中未见黑素细胞表达，毛囊及皮脂腺基底细胞中可见少量黑素细胞，且着色较浅，呈现浅黄色。模型组黑素细胞阳性表达明显增多，分布于毛囊基底细胞中，着色较深，染色成黄褐色。清斑胶囊高、中、低剂量组可以明显减少黑素细胞的表达（见图1）。
　　3.3清斑胶囊对酪氨酸酶活性的影响：不同浓度清斑胶囊对酪氨酸酶活性有显著抑制作用，各浓度之间又以高浓度的作用最强，与模型组比较差异显著。以上说明清斑胶囊良好的治疗作用与其对酪氨酸酶的抑制作用相关，且存在量效关系（见表3）。
　　
　　4讨论
　　黄褐斑形成机理极为复杂，影响因素很多，黑素产生过多沉积于皮肤是其结果，且多发于中青年女性面部皮肤[4-5]。文献报道随年龄增长，机体内抗氧化能力下降，自由基水平增加[6]，成为导致黄褐斑的主要原因之一；近年来有研究表明，酪氨酸酶在黄褐斑的发生、发展过程中同样起着重要作用，决定皮肤颜色的色素主要为黑色素，黑色素产生于表皮基底层的黑色素细胞内，由酪氨酸经含铜的酪氨酸酶的羟基化作用后形成多巴，再经氧化而形成[7]，抑制酪氨酸酶活性可以改善黄褐斑的形成。
　　目前治疗黄褐斑主要从抑制黑素细胞活性及增殖、防止黑素形成及抗氧化等方面入手，同时尽量避免和减少诱因[8]。中药治疗黄褐斑的作用是多靶点的，而黄褐斑上午发病也涉及多因素、多环节，可见中医药治疗该病具有广阔的研究前景[9]。同时中西医药物结合治疗黄褐斑亦逐年增多，临床多用以中医为主的中西医结合疗法[10]。
　　本复方从中西医两种理论角度出发，选取大豆异黄酮、白芷、VC、VE、当归、川芎组合而成，结果显示该复方能明显提高小鼠黄褐斑模型血清和肝脏中SOD、GSH的活性，降低MDA含量。同时明显降低黑素细胞的表达以及能在体外显著抑制酪氨酸酶活性。
　　综上研究表明，本复方具有良好的治疗黄褐斑功效，其治疗黄褐斑的机制可能与提高机体抗氧化能力以及抑制酪氨酸酶活性，进而阻断了黑素的形成有关。
　　
　　[参考文献]
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　　[3]过伟峰,徐 立,项晓人,等.建立小鼠黄褐斑实验动物模型的初步研究[J].中国中医基础医学杂志,2001,7(2):49-51.
　　[4]余穗娟,刘永年,金久宁,等.祛斑系列治疗黄褐斑31例临床验证报告[J].中国美容医学,2001,10(5):387-389.
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　　[9]刘平，赵百孝.中药治疗黄褐斑进展[J].中国生物美容,2010,19(1):53-57.
　　[10]张凤娥,欧阳恒,杨志波.黄褐斑的中西医治疗概况[J].湖南中医药大学学报,2007,27(6):79-80.
　　
　　[收稿日期]2011-06-23 [修回日期]2011-08-19
　　编辑/张惠娟