用scRNA-Seq技术鉴定人源化小鼠HIV-1感染过程中表达TRAIL先天免疫细胞

　用 scRNA-Seq 技术鉴定人源化小鼠HIV-1感染过程中表达TRAIL的先天免疫细胞

　 导读 HIV- -1 1 感染过程中 CD4+ + T T 细胞的耗竭主要是由炎症细胞间接介导的，但机制尚未明确。

　本研究使用单细胞测序（ scRNA- - Seq ）技术研究了 V HIV 诱导的淋巴器官固有免疫细胞的转录变化。从移植人 CD34+造血干细胞的 NOD/RAG2- / - γc - / - （NRG）小鼠脾脏中分离出 hCD45 + hCD3 - hCD19 - 白细胞，鉴定了天然免疫细胞的主要群体。

　HIV- -1 1 感染显著上调了涉及 I I 型干扰素炎症通路的基因在每个先天免疫亚群中的表达。研究发现 TRAIL 在先天免疫群体中上调。阻断 NRG-Hu HSC 小鼠中的 TRAIL 信号通路可以在体内防止 HIV-1 诱导的 CD4+ T 细胞耗尽。综上所述， 在单细胞水平上表征了 HIV- -1 1 诱导的脾脏天然免疫细胞的转录变化，鉴定了 TRAIL+ + 天然免疫细胞，并明确了 L TRAIL 信号通路在 HIV- -1 1 诱导的体内 CD4+ + T T 细胞耗竭中的重要作用。

　 实验设计

　 结果

　 1 1

　NRG- -C Hu HSC 小鼠脾脏人 CD45+ + CD3- - CD19- - 白细胞的 scRNA- -q Seq 分析

　为了全面、公正地研究人类先天免疫细胞及其在人源化小鼠体内发育的转录谱，研究人员对从 NRG- -C Hu HSC 小鼠脾脏分离的人 CD45+ + CD3- - CD19- - 细胞进行了 scRNA- -q Seq 分析。研究人员从 2只小鼠身上获得了 6023 个人类先天免疫细胞的单细胞转录本，并进行了聚类分析，以检查细胞特征和异质性。并分析了每个单个簇与所有其他细胞之间的基因表达差异，以确定簇标记基因。另使用 t 分布随机邻近嵌入（t-SNE）细胞可视化方法显示了 10 个主要簇（图 1A），基于 PDCs（例如，富集 CLEC4C、TCF4）、MDCS（CD1C、SPI1）、 巨噬细胞（CD68、CD14）、NK细胞（NKG7、PRF1）、ILC（IL7R）、 IDO+ + 髓样细胞（IDO1）、 肥大细胞（TPSAB1、CTSG）、CD34+ + 祖细胞（CD34）、B B 细胞（CD79A、CD19、CTSG）、 IDO+ + 髓样细胞（IDO1）、 肥大细胞（TPSAB1、

　CTSG）、 CD34+ + 祖细胞（CD34）、B B 细胞（CD79A、CD19、CD14）、 IL7R 、 IDO+ + 髓样细胞（IDO1）、肥大细胞（TPSAB1、CTSG），和 红系 细胞（其可能没有被红细胞裂解程序完全裂解）的标记基因表达，（图 1B，1C）。结果表明，在 在 NRG- -C Hu HSC 小鼠中形成了主要的人类先天免疫亚群，这与它们对病原体相关分子模式的反应一致，这与人类白细胞的反应相似。

　图 1. 人 CD45+ CD3 - CD19 - 免疫细胞在 NRG-Hu HSC 小鼠脾中的 scRNA-Seq 分析。（A）基于 6023 个单细胞转录本，对 NRG-Hu HSC 小鼠的 hCD45+ hCD3 - hCD19 - 脾细胞簇进行 T-SNE 分析。括号中显示了浆细胞样树突状细胞（PDC）、髓系树突状细胞（MDC）、巨噬细胞、NK 细胞（NK 细胞）、固有淋巴样细胞（ILC）、IDO+ 髓系细胞、肥大细胞、CD34+ 祖细胞、B 细胞和红系细胞的细胞计数。（B）显示每个细胞类型簇的代表性标记基因表达的小提琴曲线图。（C）标记基因在每个细胞类型簇的单个细胞中的表达热图。

　 2

　 HIV- -1 1 感染显著改变了小鼠脾脏的人先天免疫细胞的转录图谱

　研究人员通过在 单细胞水平上检测先天免疫细胞的转录组，确定了 HIV- -1 1 感染是如何改变先天免疫细胞的。

　研究人员对 HIV- -1 1 感染 3 3 周后 NRG- -C Hu HSC 小鼠脾脏分离的人 CD45+ + CD3- - CD19- -细胞进行 scRNA- - Seq。从 2 只 HIV-1 感染的小鼠共获得了 5607 个人类单细胞转录本，然后将它们与来自 2 个模拟对照小鼠的 6023 个细胞进行了比较。通过对模拟小鼠和 HIV-1 感染小鼠细胞的 t-SNE 分析，研究人员检测到来自模拟小鼠和 HIV-1 感染小鼠的全部 10 个人类先天免疫细胞簇（图 2A）。

　HIV- -1 1 感染改变了人固有免疫细胞的转录 组，包括 PDC（128 个上调基因和 35 个下调基因）、MDC（116 个上调基因和 80 个下调基因）、巨噬细胞（24 个上调基因和9 个下调基因）、NK 细胞（71 个上调基因和 76 个下调基因），以及 ILC 群体（116 个上调基因和 59 个下调基因）。通过基因 GO 富集图谱分析，发现 天然免疫亚群中大多数上调的基因与I I 型 型 N IFN 信号通路、对病毒的应答和病毒复制的负调控有关（图 2C）。通过对 HIV-1 感染差异调节基因的 Venn 图分析，发现在所有天然免疫细胞亚群中都有 15 个基因上调，并且这 15 个基因都是干扰素刺激的基因（图 2D）。这些结果表明， HIV- -1 1 感染在每个先天免疫细胞亚群中触发了 IFN- -I I 信号。有趣的是 ， HIV- -1 1 感染在每个亚群中下调的途径都与细胞代谢过程有关，这表明 HIV- -1 1 感染改变了体内人类先天免疫细胞的新陈代谢。

　 图 2. 通过 scRNA-Seq 分析 NRG-hu HSC 小鼠脾脏中的人体细胞。（A）用来自同一供体的 CD34+细胞重建的 2只模拟和 2 只 HIV-1 感染 NRG-hu HSC 小鼠脾脏的 hCD45+ hCD3 - hCD19 - 先天性免疫簇的 t-SNE 分析。不同的颜色表示左侧不同的细胞类型。蓝点表示来自模拟小鼠的细胞，而红点表示来自右侧 HIV-1 感染小鼠的细胞。（B）对于每种细胞类型，与模拟对照小鼠相比，HIV-1 感染的 NRG-hu HSC 小鼠中上调和下调基因的分布。（C）pDC、mDC、巨噬细胞、NK 细胞和 ILCs 中 HIV-1 上调通路的 GO 富集分析。（D）韦恩图显示 5 个先天性免疫亚群中HIV-1 上调的基因重叠。

　 3 HIV- -1 1 感染可诱导所有主要天然免疫亚群 L TRAIL 的表达

　 艾滋病发病的标志是 CD4+ + T T 细胞逐渐耗尽。然而，HIV-1 感染导致体内 CD4+ T 细胞耗尽的机制尚不清楚。因此，研究人员分析了 HIV-1 感染诱导的先天免疫细胞的变化是否以及如何导致CD4+ T 细胞耗尽。他们发现 编码 L TRAIL 的 的 F TNF 超家族成员 10 （ TNFSF10 ）基因在 pDC 、 MDCS 、巨噬细胞和 K NK 细胞以及 C ILC 细胞中被 HIV- -1 1 显著诱导（图 3A，3B）。TRAIL 在每个主要的先天免疫亚群中都是前 25 个差异表达的基因之一。TRAIL+ pDC 的百分比从模拟小鼠的 3.5%增加到HIV-1 感染小鼠的 37%（图 3B）。HIV-1 感染还导致 MDCS（从 21%到 66%）、巨噬细胞（从 32%到 81%）、NK 细胞（从 14%到 38%）和 ILC（从 28%到 56%）的 TRAIL 表达增加 2 到 3 倍（图 3B）。利用流式细胞术，研究人员证实了 HIV-1 感染后 PDCs、MDCs、巨噬细胞、NK 细胞和 ILC 中 TRAIL蛋白的表达上调（图 3C）。

　接下来，确定在 HIV-1 感染的小鼠脾脏中，表达 TRAIL 的先天免疫细胞是否与 TRAIL 细胞相比具有独特的转录组。TRAIL+ 细胞和 TRAIL - 细胞的差异基因表达分析显示，TRAIL + 细胞在 pDC、MDCS 和 NK 细胞中表达更高水平的 IFN 刺激基因，如 IFIT3、ISG15 和其他 IFN 刺激基因（图3D 和补充表 3）。TRAIL+ 细胞上调基因的字符串网络分析显示， IFN- -I I 信号通路在表达 TRAIL的 的 pDC、 、S MDCS 和 和 K NK 活 细胞中优先激活（图 3E），而 TRAIL+ 和 TRAIL - 巨噬细胞以及 TRAIL + 和 TRAIL-ILC之间的基因转录没有明显变化。

　 图 3. HIV-1 感染诱导所有先天性免疫细胞亚群表达 TRAIL。（A）通过 t-SNE 可视化检测模拟和 HIV-1 感染小鼠的人先天性免疫细胞中 TRAIL 的表达。（B）标准化唯一分子标识符（UMI）的小提琴图显示 TRAIL（TNFSF10）基因表达在模拟或 HIV-1 感染小鼠不同先天性免疫细胞中的分布。（C）HIV-1 感染后 5 周，通过流式细胞术检测模拟和 HIV-1 感染小鼠脾脏中每个先天性免疫细胞亚群的 TRAIL 蛋白表达。（D）Heatmaps 显示 TRAIL+和 TRAIL–细胞在 HIV-1 感染小鼠的 pDC、mDC 和 NK 细胞中的差异表达基因。（E）HIV-1 感染小鼠 TRAIL+细胞中 pDC、mDC 和 NK 细胞类型上调基因的 STRING 关联网络。

　 4 阻断 5 TRAIL/DR5 信号通路可在体内预防 HIV- -1 1 感染引起的 CD4+ + T T 细胞耗竭

　在先前的研究中，发现 HIV- -1 1 感染在体内诱导 CD4+ + T T ，细胞凋亡， caspase- -3 3 表达活跃。

　TRAIL是一种促凋亡配体，具有促进根除感染或恶性细胞的免疫效应功能。以上结果表明，V HIV 诱导的先天免疫细胞表面 L TRAIL 的表达可能与淋巴器官中 CD4+ + T T 细胞的耗竭有关。因此，研究人员在体内检测 HIV-1 感染后 CD4+ T 细胞上是否诱导了 TRAIL 的死亡受体，发现 HIV1 感染上调了人源化小鼠脾脏 CD4+ T 细胞 TRAIL 受体死亡受体 5（DR5）的表达，但不上调死亡受体 4（DR4）的表达（图 4A）。为了阻断 TRAIL/DR5 信号轴，研究人员使用了一种可溶性形式的 DR5 与人 IgG-Fc融合（sDR5-Ig），它可以防止 TRAIL 诱导的细胞死亡。后用 sDR5-Ig 治疗 HIV-1 感染的 NRG-Hu HSC 小鼠，从感染后第 5 天到第 35 天，每周两次，并分析治疗是否影响 HIV-1 的复制和防止体内 CD4+ T 细胞的耗尽。虽然 sDR5-Ig 治疗不影响 HIV-1 在体内的复制（图 4B），但它有效地防止了 HIV 引起的外周血和脾脏中 CD4+ T 细胞和 CD8 + T 细胞的耗尽（图 4C，4D）。

　此外，研究人员检测到 HIV-1 感染后 CD4+ T 细胞中活性 caspase-3 的表达升高，caspase-3是凋亡的替代标志物。

　发现 sDR5- -g Ig 显著降低了 V HIV 诱导的脾脏 CD4+ + T T 细胞中 caspase- -3 3 的活化，表明阻断 TRAIL/DR5 5 信号通路可以阻止 CD4+ + T T 细胞凋亡（图 4E）。然而，sDR5-Ig 治疗并没有挽救因 HIV-1 感染而受损的 T 细胞的功能。综上所述， 在单细胞水平上证实 L TRAIL 在多个人类先天免疫亚群中上调，并证明 L TRAIL 信号通路的激活与体内 HIV- -1 1 感染过程中 CD4+ + T T 细胞的耗竭有关。

　 图 4. 体内阻断 TRAIL 信号可阻止 HIV-1 诱导的 CD4+ T 细胞耗竭。（A）代表性流式图和分析数据显示 HIV-1感染后 3-5 周模拟和 HIV-1 感染小鼠 CD4+ T（CD3 + CD8 - ）细胞上 DR5 的表达。（B—E）感染 HIV-1 的 NRG-hu HSC小鼠于感染后 5～35d 给予 sDR5-Ig 或对照 Ig 治疗，每周 2 次（200μg/只，腹腔注射）。（B）显示 HIV-1 感染后指定时间点的血浆 HIV-1 RNA 水平。（C 和 D）总结处死时（第 35 天）外周血（C）和脾脏（D）中 CD4+ T细胞（CD3+ CD8 - ）的数量。（E）代表性流式图和分析数据显示了表达活性 caspase-3 的脾脏 CD4 + T 细胞（CD3 + CD8 - ）的百分比。

　 结论

　 本研究利用单细胞水平上的 scRNA- -q Seq 技术，研究了 HIV- -1 1 感染对 NRG- -C Hu HSC 小鼠淋巴器官中人先天免疫细胞转录组的影响。结果显示， HIV- -1 1 感染显著改变了每个先天免疫细胞亚群的转录组。L TRAIL 在先天免疫人群中显著上调，阻断 L TRAIL 信号通路可以防止体内 HIV- -1 1 诱导的 CD4+ + T T 细胞耗尽。HIV-1 在人源化小鼠体内的感染为研究 HIV-1 疾病或 AIDS 的体内发病机制提供了一个有价值的平台。