紫外线手电筒【中波紫外线对HaCaT细胞增殖活性的影响】

　　[摘要]目的：探讨中波紫外线（UVB）对HaCaT细胞损伤的影响。方法：取对数生长期的HaCaT细胞，用0、30、60、90 mJ/cm2剂量的UVB照射后继续培养0、24、48、72h，在倒置显微镜下观察其形态学变化，用MTT法检测UVB照射对细胞增殖活性的影响。结果：在30～60mJ/cm2的UVB辐射下，随辐射剂量的增大，细胞的增值活性逐渐下降，而细胞的凋亡率逐渐增加，倒置相差显微镜从形态学上证实了细胞的凋亡改变。结论：UVB可诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性。
　　[关键词]中波紫外线；辐射；HaCaT细胞；损伤
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）03-0419-03
　　
　　Effect of HaCaT cells proliferation by Ultraviolet-B Radiation
　　CHEN Chen1，SHI Yu-jie2，JIANG Zhen-you1, YANG Jian2
　　（1.School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632,Guangdong,China; 2.Department of Dermatology, th e Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of damadge on HaCaT cells irradiated by Ultraviolet-B Radiation （UVB）(0、30、60、90mJ/cm2). MethodsThe dose- and time- dependent photodamage was observed by light microscopy. MTT assay was used to record cellular activity.Results The irradiation damage of HaCaT cells was dependent on the irradiated dosages (0、 30、60、90mJ/cm2). Conclusion UVB can induce damadge of HaCaT cells.
　　Key words: UVB; irradiation; HaCaT cells; damadge
　　
　　皮肤是日光辐射直接作用的靶器官，紫外光按照波长的长短分为UVC(200～280nm)、UVB（280～315nm）、UVA（315～400nm），其中UVB是紫外光最少的一部分，虽然紫外光对人体是有益的，但大量的紫外光辐射，尤其是UVB，会对人体健康造成威胁[1]。笔者采用不同剂量的UVB对HaCaT细胞进行辐射，以MTT法检测UVB照射对细胞增殖活性的影响，并在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，现报道如下。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1人角质形成细胞（HaCaT细胞）购自中国典藏培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），在DMEM培养基（Gibco，美国）中培养。胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）均购自美国Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
　　1.1.2主要仪器设备：紫外光源（UVB灯管）为北京电光源研究所产品（功率8W，波长305nm）。UVB紫外线辐照计购自北京师范大学光电仪器厂。流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），倒置相差显微镜（Olympus，日本），CO2培养箱（Napco 5400，日本）。
　　1.2实验方法
　　1.2.1细胞培养、分组和照光处理：取HaCaT细胞培养于含有体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中，于37℃、95%湿度及体积分数5% CO2条件下培养、传代。取对数生长期的HaCaT细胞，经0.5%胰蛋白酶+0.03%EDTA消化后用含10%小牛血清的DMEM培养基以1×105个/ml细胞密度接种于96孔培养板中，当细胞融合80%以上且处于对数生长期，吸去各组培养细胞培养液，用PBS冲洗一次，并加入少量PBS覆盖底面。用铝箔纸做避光处理，解开需要处理的孔，用UVB进行照射，并以UVB辐射度监视器标定照射强度，UVB剂量=UVB辐射度×时间（s）。培养板距灯管15cm，辐射总剂量分别为0、30、60、90mJ/cm2，照射完毕后加入完全培养基继续孵育至0h、24h、48h、72h。
　　1.2.2 倒置相差显微镜观察细胞形态学变化：以剂量0、30、60、90mJ/cm2UVB辐射细胞，在照射后0h、24h、48h、72h以倒置显微镜观察细胞损伤的形态变化。
　　1.2.3 MTT法测定HaCaT细胞增殖活性：将100μl密度为1×105 个/ml HaCaT细胞悬液接种于96孔内，经0、30、60、90mJ/cm2照射处理，每组6个复孔，继之更换新鲜培养液，继续培养12h，各孔加入MTT 10μl（浓度为5mg/ml），再孵育4h后弃去上清液，加入150μl二甲基亚砜（DMSO），室温振荡15min，于570nm波长测定每组吸光度（A）值，观察各组细胞的增殖活性并绘制细胞生长曲线。
　　1.3 统计学方法：以SPSS13.0统计软件对实验数据进行t检验和单因素方差分析，当P�0.05时认为差异有统计学意义。
　　
　　2结果
　　2.1 UVB光损伤的形态学观察 未经照光处理的HaCaT细胞经过一段适应期贴壁后很快进入对数生长期，生长状况良好，细胞呈典型上皮样特征，呈铺路石样形态，高核浆比例，细胞排列紧密，轮廓清楚折光好。亚融合状态的细胞接受不同剂量30、60、90mJ/cm2 UVB照射后24h受到不同程度的损伤，呈剂量依赖性，表现为细胞肿胀变圆、皱缩、细胞碎片增多，部分漂浮于培养液中。30mJ/cm2 UVB辐照后损伤变化最轻，细胞稍肿胀，部分脱落；60mJ/cm2 UVB辐照后细胞肿胀，部分坏死、脱落，部分细胞空泡变性、核固缩；90mJ/cm2 UVB辐照后细胞肿胀明显，坏死、脱落较60mJ/cm2 UVB明显（图1）。当HaCaT细胞接收相同的辐射剂量30mJ/cm2 UVB照射后，继续培养，分别在0h、24h、48h、72h时间点进行观察，表现为细胞逐渐肿胀，出现核固缩，坏死，脱落（图2）。
　　2.2不同剂量UVB 0、30、60、90mJ/cm2辐射HaCaT细胞24h后用MTT法测定HaCaT细胞增殖活性，经t检验，30、60、90mJ/cm2 UVB组与0 mJ/cm2 UVB组相比较，各组P＜0.001，差异有统计学意义（表1）。
　　2.3 30mJ/cm2 UVB辐射HaCaT细胞后分别在0h、24h、48h、72h时间点测定细胞增殖活性，未经照光的HaCaT细胞具有良好的细胞增殖能力核较高的细胞活性，MTT法检测显示对照组细胞活性随培养时间的增加而迅速增殖生长；而照光组细胞在照光后24h、48h、72h，MTT检测均显示细胞活性较对照组为低（t=4.974，P=0.001；t=17.634，P=0.000；t=26.042，P=0.000），且在长达72h的观察过程中，细胞活性并无明显回升（图3）。
　　
　　3讨论
　　不同的紫外线对人体皮肤损害作用不同，其中UVB比UVA具有更强的诱变性和致癌性[2]。本研究采用UVB光源，以HaCaT细胞为辐射细胞，进行光损伤方面的研究。结果显示，不同剂量UVB对细胞的损伤呈剂量依赖性，剂量越大，对细胞的损伤越重，细胞增殖活性随照射剂量增大而下降，表现为细胞逐渐变圆、皱缩，悬浮细胞增多，碎片增多。在形态上进一步证实了UVB可诱导HaCaT细胞的凋亡。实验发现，在相同剂量的UVB辐射下继续培养细胞，细胞增殖生长受抑制，而未照光对照组细胞生长状况良好，很快进入对数生长期。30mJ/cm2的UVB照射剂量与Sittailo等建立UVB损伤模型时采用的计量相当[3]，此计量相当于海平面1～2min的日晒量，UVB到达地球表面时的辐射强度约为18～30mJ/cm2[4-6]。夏济平等[7]发现，小剂量UVB辐照（210～420J/m2）能够诱导角质形成细胞凋亡，而较大剂量（1 260J/m2）的UVB照射可直接导致HaCaT细胞坏死。我们的研究从体外初步观察了UVB照射对HaCaT细胞的影响，中波紫外诱导表皮细胞凋亡的药物调控值得进一步研究。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Tyrrell RM,Reeve VE.Potential protection of skin by acute UVA irradiation-From cellular to animal models[J].ProgBiophys Mol Biol,2006,41:1197-1204.
　　[2]Marrot L,Meunier JR.Skin DNA photodamage and its biological consequences[J].J Am Acad Dermatol, 2008,58(5 Suppl 2):139-148.
　　[3]Sitailo LA,Tibudan SS,Denning MF. Activation of caspase-9 is required for UV-induced apoptosis of human keratinocytes[J].J Biol Chem,2002,277(22):19346-19352.
　　[4]Kimura H,Minakami H,Otsuki K,et al. Cu-Zn superoxide dismutase inhibits lactate dehydrogenase release and protects against cell death in murine fibroblasts pretreated with ultraviolet radiation[J].Cell Biol Int,2000,24(7):459-465.
　　[5]Zhong JL,Raval C,Edwards GP,et al. A role of Bach1 and HO-2 in suppression of basal and UVA-induced HO-1 expression in human skin keratinocytes[J].Free Radical Biol Med,2010,48:196-206.
　　[6]Zhong JL,Edwards GP,Raval C,et al. The role of Nrf2 in Ultraviolet A mediated heme oxygenase 1 induction in human skin fibroblasts [J]. Photochem Photobiol Sci,2010,9:18-24.
　　[7]夏济平,宋秀祖,毕志刚. 紫外线诱导角质形成细胞凋亡和表没食子儿茶酚没食子酸酯保护机理的探讨[J].中华皮肤科杂志,2003,36(11):632-634.
　　
　　[收稿日期]2010-10-29 [修回日期]2011-02-12
　　编辑/张惠娟