【豆天蛾中氨基酸成分提取和含量测定】 氨基酸含量

　　[摘要] 目的 研究豆天蛾酸水解提取氨基酸的提取工艺,及其氨基酸的种类和含量。方法 通过正交试验以总氨基酸的含量为指标,确定合理的酸水解工艺,采有HPLC柱前衍生法测定各氨基酸的含量。结果 酸水解的最佳工艺为:酸浓度为10N,加酸水量3倍,温度为140℃,水解3h,氨基酸的得率最高,为689.05mg/g。水解液中有17种氨基酸,氨基酸的含量为630.15mg/g,其中谷氨酸含量最高,为83.809mg/g。
　　[关键词] 豆天蛾;氨基酸;酸水解;HPLC
　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A[文章编号]
　　
　　Study on Amino acid compounds and acid-catalysed hydrolyses of Clanis bilineata tsingtauica
　　ZHAN Yong-Cheng, LIU Tao, LI lu
　　(1 Department of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technolngy, Lianyungang 222005,
　　 2Jiangsi Kanion Pharmaceutical Co. Lid., Lianyungang 222001)
　　[Abstract]To study the acid-catalysed hydrolytic method and the contents of amino acids in Clanis bilineata tsingtauica, the acid-catalysed hydrolyses was performed by the orthogonal experiment. The results showed that the optimal conditions were as follows: acid 10N, ratio of stuff to solvent 1:3, temperature 140℃, and hydrolytic time 3h. Under the optimal conditions, the extraction rate of amino acids as 68.9%. The technology of precolum derivatization, along with high performance liquid chromatography gradient elution was used in determining the contents of amino acids. The results showed more than 17 amina acids in it .
　　[Key words]Clanis bilineata tsingtauica, amino acid, acid-catalysed hydrolyses, HPLC
　　
　　豆天蛾(Clanis bilineata tsingtauica)为天蛾科豆天属昆虫,俗称“豆丹”、“豆参”,是连云港地区最具代表性的地方特色产品之一,被誉为“国内少有,苏北仅有,灌云特有”的美味珍品[1]。在医药上,豆丹具有降血压、降血脂作用,对高血压、冠心疾和肠胃病等有独特的疗效。吴胜军[1]等对豆天蛾的营养成分进行了初步的研究,前文报道了豆天娥中油脂的提取及其脂肪酸的组成[2],本文研究了酸水解法提取氨基酸的工艺,和采用柱前衍生HPLC法测定了氨基酸的种类和含量。
　　1仪器与试剂
　　高效液相色谱仪(Waters公司,Waters 600泵系统,2996PDA检测器,717自动进样器);混合氨基酸标准液(含17种氨基酸,Waters公司提供);6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC,衍生试剂,Waters公司);流动相A,醋酸盐-磷酸盐缓冲液(Waters公司);乙腈(色谱纯),DF-1集热式磁力搅拌器(金坛市荣华仪器公司),液体石蜡,硫酸,氢氧化钠,百里酚酞,锌粉,乙醇,甲醛。
　　2 方法与结果
　　2.1蛋白质酸水解工艺的考察
　　2.1.1考察因素和水平:选择了料液比,水解酸浓度,水解时间,水解温度等4个因互素,每个因素选择3个水平,编制因素水平表(1)。
　　2.1.2试验与结果:称取干燥至恒重的豆天蛾粉末100g,加入石油醚(30-60℃)约500ml,加热回流脱脂90min,过滤得药渣,挥干石油醚,称量脱脂后的粉末7.7g,按L9(34)正交表设计方案进行试验,以氨基酸总量为指标进行分析,结果见表(2)
　　总氨基酸的含量测定(甲醛滴定法)[3]:取氨基酸水解液减压蒸馏,加纯化水定容100ml,取上述溶液10ml加纯化水定容于50ml溶量瓶中,混匀后吸取20.00ml置于200ml烧杯中,加纯化水60ml,开动搅拌器,用0.05000M的NaOH标准溶液滴定至pH为8.2,加入10.00ml甲醛溶液,混匀,再用NaOH标准溶液滴定pH为9.2,记录后消耗的NaOH标准溶液体积V1;同时,取纯化水作空白,如上操作,得消耗的NaOH标准溶液体积V1。
　　W=(V1-V2)×C×0.01401×n/m
　　W:样品中氨基酸态氮的质量分数;C:NaOH标准溶液的浓度;
　　n:样品稀释释的倍数; m:测定用样品的质量;
　　0.01401:氮的毫摩尔质量。
　　由试验结果可知,A、B、C、D四个因素对豆天蛾中氨基酸含量的影响程度不同,各因素的影响程度依次为B>C>D>A,最佳工艺为A1B3C3D3,即酸浓度为10N,加酸水量3倍,温度为140℃,水解3h。
　　2.1.3验证试验
　　称取干燥至恒重的豆天蛾粉末30g,加入石油醚(30-60℃)约150ml,加热回流脱脂90min,过滤得药渣,挥干石油醚,称量脱脂后的粉末7.7g,按酸浓度为10N,加酸水量3倍,温度为140℃,水解3h,进行试验,结果氨基酸总量平均为689.05mg/g。
　　2.2 HPLC法测定氨基酸种类和含量[4]
　　2.2.1仪器方法::色谱柱: Accq.tag 150mm * 3.9mm ; 检测器: PDA 248nm ; 柱温: 36 ℃ ; 进样量: 10ul ; 流动相梯度设置如表(3)。
　　2.2.2 流动相的配制
　　由 Waters 公司提供的磷酸盐缓冲液 A 浓液按 1 : 10 ( V/V )用水稀释:取 30 毫升 A 浓液,置于 500 毫升瓶中,再取 300 毫升高纯水,倒入该瓶中,混合均匀,备用。
　　2.2.3 氨基酸稀释标样配制
　　打开一瓶氨基酸标样,用进样针移取 10 微升,放入衍生管中,加 90 微升纯水,混匀,备用。(氨基酸标样浓度为 2.5um/ml ,其中胱氨酸浓度为 1.25um/ml 。稀释后则为 0.25um/ml ,胱氨酸浓度为 0.125um/ml )。
　　2.2.4 衍生剂 AQC 的配制
　　取有一定量的 AQC 瓶,在打开之前,轻轻弹击,确保所有的 Accq.tag 试剂粉末全落在瓶底;移液管吸取 1 毫升的乙腈放入该瓶中,加盖密封,震荡 10 秒钟;在 55 度的加热装置上,加热至粉末全部溶解。加热时间不要超过 10 分钟。
　　2.2.5 氨基酸样品的衍生
　　用进样针吸取 10 微升已稀释的标样于一衍生管中,加 70 微升的 accq.tag 硼酸盐缓冲液,涡旋混合;再加 20 微升刚配制好的衍生剂。涡旋混合 10 秒。将衍生管用石蜡膜封口,放在 55 度烘箱中加热 10 分钟。取出,进样。
　　精密量取验证试验水解氨基酸样品(定容于100ml)3ml,加纯化水定容于5ml容量瓶中,按上法进行衍生化,进样前先用溶剂过滤膜过滤。
　　2.2.6 实验结果
　　根据外标,保留时间定性,峰面积定量后得出实验结果,列表如下。其中氨基酸含量最多的是谷氨酸,为83.81mg/g。豆天蛾中氨基酸总含量为: 630.15mg/g 。
　　同时,为了保证实验的准确性和精确性,对豆天蛾水解液进行了 3 次重复性实验,证明重复性比较好, RSD 都在 5% 左右.
　　3 结论
　　豆天蛾中含大量蛋白质,采用酸浓度为10N,加酸水量3倍,温度为140℃,水解3h,氨基酸的得率最高,为689.05mg/g。采用柱前衍生HPLC法测定其中含有17种氨基酸,总量为630.15mg/g,其中必需氨基酸含量丰富,为247.857mg/g,约占总氨基酸含量的40%。豆天蛾幼虫具有相当丰富的蛋白质含量,比鸡蛋等食物高, 豆天蛾幼虫中其必需氨基酸占总氨基酸的比例在食物中表现有明显优势。
　　
　　参考文献
　　[1] 吴胜军,孟旭,陈绍军. 豆天蛾主要营养成分的分析与评价[J]. 淮海工学院学报,2000,9(1):58-61.
　　[2] 詹永成,刘涛,李路. 豆天蛾中油脂的提取及脂肪酸组成分析[J]. 中国食物与营养,2009,(2):52-54.
　　[3] 高向阳. 食品分析与检验[M]. 北京:中国计量出版社,165-166.
　　[4] 陈发河,吴光斌,陶金华. 柱前衍生液相色谱法测定贝类中氨基酸的含量[J]. 海洋水产研究,2006,27(3):43-46.