积雪草甙对兔耳增生性瘢痕ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ表达的影响|积雪草甙

　　[摘要]目的：通过建立兔耳腹侧增生性瘢痕的模型，探讨积雪草甙（Asiaticoside,Ad）对TGF-β1 mRNA表达的影响。方法：新西兰大白兔20只（喂养过程中死亡4只），在兔耳腹侧制备直径为1cm、深达软骨膜的圆形瘢痕93个，随机分为4组：空白对照组、得宝松组、低浓度积雪草甙组（25mg/ml）、高浓度积雪草甙组（50mg/ml），分别于瘢痕制备3天后局部应用相应药物，2周后取材，分别测量瘢痕组织TGF-β1 mRNA的表达量。结果：积雪草甙组与空白对照组相比，TGF-β1mRNA表达量明显降低，有明显统计学差异（P0.05）；积雪草甙组之间，高浓度组与低浓度组相比有统计学差异（P0.05） between asiaticoside group and masculine group. As to the two asiaticoside groups, group of higher concentration has a lower expression of TGF-β1 mRNA and the difference is significant.ConclusionHigher concentration of asiaticoside injected could inhibittheexpressionofTGF-β1 mRNA
　　Key words: hypertrophic scars; TGF-β1;asiaticoside;quantitative RT-PCR
　　
　　增生性瘢痕的形成是由于皮肤创伤后的愈合过程中成纤维细胞过量增殖和胶原纤维过度增生的结果，增生性瘢痕的防治是现代医学的难题之一，寻找治疗和预防瘢痕增生的药物具有重要的意义。积雪草甙为积雪草提取物三萜皂甙的主要成分之一，已有的资料显示，在各种皮肤损伤修复治疗中，无论是在正常创面，还是在延迟愈合的创面中，积雪草甙（Asiaticoside，Ad）均具有促进皮肤损伤修复的药物活性。临床上，已有积雪草甙的片剂和霜剂的应用，本实验是对兔耳增生性瘢痕的局部注射该提取物，通过RT-PCR方法对比研究其前后TGF-β1 mRNA的表达有无统计学差异，进而为临床上治疗增生性瘢痕寻找新的治疗途径。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 实验动物及主要试剂、仪器：新西兰大白兔20只，体重2.2～2.7kg，雌雄不拘，购自山东省实验动物中心，由青岛大学医学院附属医院实验动物中心代为饲养。适应性喂养1周，死亡2只，剩余18只。积雪草甙标准品，由西安市小草植物开发有限公司惠赠； SYBRPremixScript 逆转录试剂盒及定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；RT-PCR引物： TGF-β1 mRNA 序列取自美国基因库，引物采用Primer5软件设计，所有引物由上海生工生物技术有限公司合成（见表2）；冷冻高速离心机(日本Sigama公司)、7500 型荧光定量 PCR 仪(美国Bio-Rad公司)、普通离心机、研磨机、震荡仪、-70℃冰箱
　　1.2 兔耳瘢痕模型的制作：氯胺酮和地西泮按分别按2mg/kg和5mg/kg肌肉注射麻醉，然后在兔双侧耳腹侧分别作3～4个直径为1cm的圆形切口，切口间距1cm，完整切除皮肤全层至软骨膜表面，并切除软骨膜，保留耳软骨。创面压迫止血后予以暴露，无需包扎。术后3天死亡2只，剩余16只，共形成高出正常皮肤的瘢痕块93个。
　　随即选择每只兔的左右侧耳进行药物对比观察，分为空白对照组―低浓度积雪草甙组、空白对照组�高浓度积雪草甙组、空白对照组�得宝松组、低浓度积雪草甙组�高浓度积雪草甙组、低浓度积雪草甙组�得宝松组、高浓度积雪草甙组�得宝松组；共得到空白对照组19个瘢痕块、得宝松组22个、低浓度积雪草甙注射组24个（25mg/ml）、高浓度积雪草甙注射组28个（50mg/ml），各组分别于瘢痕制作后3天开始隔天局部注射得宝松和相应浓度积雪草甙药液0.5ml/个，各组局部药物注射均持续至瘢痕制作术后10天。于瘢痕制作术后2周切取瘢痕组织标本。
　　1.3 HE染色：于瘢痕制作2周后切取瘢痕组织，随即固定于中性甲醛液，常规石蜡包埋，4μm切片，切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，然后苏木素染色5min、自来水冲洗，盐酸盐酸乙醇化30s，置伊红液2min，再经常规脱水、透明、封片，镜检。
　　1.4 总RNA的提取：应用TRIzol试剂盒，方法按说明书进行。所提取的总RNA用紫外分光光度计定量，A260/A280值≥1.8的进入下一步实验。
　　1.5 实时定量荧光PCR扩增：逆转录反应严格按照试剂盒操作说明进行；PCR扩增反应体系（20μl）含SYBRPremix ExTaqTM（10μl），PCRForwardPrimer(0.7μl)，PCRReversePrimer(0.7μl)，ROX Reference Dye II(0.4μl)，dH2O(5.1μl)，cDNA(2μl)。反应条件：90℃10s, 94℃5s,60℃45s,共40个循环。 TGF-β1 mRNA 的定量：采用相对定量法。以GAPDH为参照，利用Ct值计算TGF-β1 mRNA 的相对量。TGF-β1 mRNA/GAPDH用下述公式计算：2-△ct。
　　1.6 统计学方法：采用SPSS11.5统计软件处理系统，组间差异采用t检验进行比较。P0.05），提示高浓度积雪草甙具有临床推广应用的动物实验基础。
　　本实验局部应用多种药物对兔耳瘢痕进行治疗，得宝松对于兔耳瘢痕具有较明显的疗效，这与以往的报道基本相同。积雪草甙局部注射可以明显抑制TGF-β1 mRNA的表达，并且在一定范围内疗效与药物浓度成正比。与口服积雪草甙片剂相比较，局部注射可以大大减少全身的副作用，而与积雪草甙霜剂相比，局部注射能更大地提高瘢痕局部的药物浓度。与局部注射糖皮质激素可引起色素脱失、骨质疏松、月经紊乱等相比较，中药的副作用更小，尤其对于禁忌使用糖皮质激素的患者。因此，积雪草甙瘢痕内局部注射具备临床推广的价值。但由于中药本身成分复杂，其具体作用机理往往是多靶点、多环节地，亟需更深层次的研究为其临床治疗提供有力的依据。
　　
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　　[收稿日期]2008-09-22[修回日期]2008-12-10
　　编辑/张惠娟