骨髓间充质干细胞提取 [骨髓间充质干细胞在皮肤创面修复中应用的研究进展]

　　随着组织工程技术的发展，开发构建组织工程皮肤逐渐引起人们的关注，但种子细胞的来源是目前困扰组织工程的问题之一。骨髓间充质干细胞（BMSC）是一类多能干细胞，能分化为骨、软骨、肌肉和脂肪等多种间充质组织。无论从它的来源、分离方法还是可分化组织类型来看都有其独特的优势，是近年来研究的一个热点，易于分离、培养、扩增，在体外长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景稳定。本文就骨髓间充质干细胞的特性及其在创面修复中的应用作一综述。
　　
　　1骨髓间充质干细胞的生物学特性
　　1968年，Friedenstein等[1]利用自然贴壁法从获得的骨髓基质细胞中首先证明了骨髓中间充质干细胞的存在，并发现在塑料培养皿中培养的贴壁骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等，而且这些细胞经过20～30个培养周期仍能保持其多向分化潜能[2]。Conget等[3]发现人BMSC中约有20%处于静止期，足以维持增殖分化所需的细胞供给；体外培养扩增中，不自动分化。实验证明机体内除了骨髓外，在脐血[4]、外周血[5]中也存在有间充质干细胞，在一定诱导条件下与BMSC分化方向一致[6]。目前，BMSC的表面标志尚不确定。利用流式细胞仪观察到的结果显示BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，主要包括：CD105(SH2)、CD73(SH3、SH4)、CD29、CD44、CD54、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD106等，不表达造血细胞的表面标志，如CD34、ClyA、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLA-DR抗原等[7-8]。这为BMSC广泛应用提供了分子基础。
　　
　　2分离、培养和鉴定
　　目前用于分离BMSC的方法主要有三种：①密度梯度离心法：鉴于间充质干细胞与其他细胞密度的差异，采用分离液来实现细胞间的分离。其中使用Percoll分离液获得的细胞纯度高，形态和性质均一。因此，目前广泛采用的是利用密度梯度离心法来分离纯化BMSC；②贴壁筛选法：根据BMSC易于粘附塑料底物的特性来实现与非贴壁细胞分离；③流式细胞仪分选术：根据细胞大小或者细胞表面的一些特殊标志来进行分离。现在国外已经建立了一种简单、经济、高效的分离BMSC的方法，即利用一种具有3μm孔径的塑料培养皿从骨髓中筛选BMSC，这种方法筛选出来的BMSC均质性大于98%。也具有自我增殖和更新及分化为各种结缔组织的能力[9]。在生理稳态情况下，成年机体内大多数BMSC并不增殖。然而，在仅补充了适宜血清的培养液中，它们就能贴附在塑料培养器皿壁上生长，分泌多种细胞因子，通过细胞表面的多种受体相互作用刺激细胞的迅速增殖[10-12]。有多种因素能影响BMSC的生长和扩增。培养条件中，最重要的影响因素是血清的促生长作用。间充质干细胞的培养可采用常规的细胞培养方法。大多数体外培养研究证明BMSC具有强大的扩增能力。Colter等[13]报道，将人骨髓基质原代细胞低密度培养生成的单个大集落的细胞重复作低密度传代培养，每次传代仅用最大的细胞群体倍增大约50次；尽管BMSCs具有强大的体外扩增能力，但是扩增后的BMSC的寿命是有限的。这可能与BMSC的端粒酶活性很低有关[3]，对细胞周期研究显示，只有少数间充质干细胞正在活跃地复制，大多数细胞处于GO／G1期，暗示着间充质干细胞有高度的分化潜能。大量的体外实验证明，BMSC具有多向分化特征，在不同诱导条件下，向不同目的细胞分化[14-18]。
　　近年来，随着对BMSC研究的深入，逐渐发现BMSC在损伤等刺激下能参与多种组织的修复作用[19-21]，BMSC免疫原性弱，移植时可不使用免疫抑制剂，不会引起免疫排斥反应[22]，植入部位没有观察到肿瘤的发生。因此，BMSC是细胞移植的理想选择。
　　
　　3骨髓间充质干细胞与皮肤创面修复
　　创面愈合的过程涉及细胞运动、粘附、通讯、增殖、迁移和分化等细胞学行为，同时也包含细胞内外物质的代谢、基因的启动和调控等一系列生物化学和分子生物学反应。概括起来可分为炎症反应、肉芽组织增生、创面再上皮化及创面愈合后的改建等过程。而BMSC的生物学特性，满足创面修复的需要。
　　目前，虽然多种皮肤移植物、皮肤替代品和促进创面愈合的生物制剂已经用于临床，但不能满足临床的各种需求。大量研究以BMSC为种子细胞，根据组织工程原理来修复创面以解决皮源问题并得出了肯定性结论[23]。Mackenzie等[24]发现人间充质干细胞来源的修复细胞在受损组织中大量存在，参与其再生，这项发现为更进一步探索间充质干细胞的生物学特性和定向移植提供了一个广阔前景。Satoh等[25]研究证实局部创面应用间充质干细胞可以促进皮肤损伤修复并提高愈合质量。Shumakov等[26]将间充质干细胞移植应用于成体大鼠上，他们发现自体移植和异体移植都减少了创面浸润，加速了肉芽组织形成，尤其在自体移植间充质干细胞组更为显著。经荧光显微镜观察，创面愈合的质量与被移植细胞所发挥效能的时间长短有关。推测其更能有效地促进烧伤创面愈合。Glowacki等[27]通过鼠骨髓移植实验的检测发现，骨髓源细胞在体内可分化为表皮细胞，并可长期存在。Rasulov等[28]对l例大面积烧伤患者进行异体移植间充质干细胞的细胞治疗，并于细胞移植后第4天实施自体皮肤移植术。结果证实经间充质干细胞治疗可以辅助创面愈合过程中血管的生成，缩短患者康复时间。McFarlin等[29]将BMSC静脉注射到SD大鼠，发现创面胶原蛋白的生成增加，促进了皮肤创面的愈合。最近，骨髓基质干细胞已被证明能加速糖尿病大鼠创面愈合[30]。有研究表明骨髓基质干细胞分泌的基质细胞衍生因子1α能促进小鼠皮肤血管增生和放射伤口的愈合[31]。骨髓间充质干细胞促进伤口愈合的动物研究[30,32,33-35] 中，除了证明骨髓间充质干细胞能明显加速创面愈合，促进上皮再生和血管生成外，也证实它可以改善修复皮肤的质量[34]。
　　以上研究表明，BMSC能够促进新生血管形成，加速创面愈合，且具有来源丰富、易于分离、长期传代不改变生物学特征、组织修复能力强等优点。因此，它将逐渐成为理想的组织工程化皮肤种子细胞的新来源。
　　
　　4问题与展望
　　BMSC研究在近年取得了显著的进展，它易于获得及移植且可避免排斥反应的特性，使其具有重要的研究和应用前景，取得了令人举目的成果，但是仍有许多问题尚未解决。目前，BMSC分化为多种类型细胞的分子机制和分化能力尚未完全阐明，BMSC特异性的表面标记和移植BMSC的最佳时机尚不清楚，有待我们进一步解决。相信随着BMSC研究的深入，人们会以它为突破口，真正实现以BMSC为种子细胞的现代组织工程造福于人类，并广泛应用于临床。
　　
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　　[收稿日期]2010-11-01[修回日期]2011-01-10
　　编辑/李阳利