影响再生能力的因素 毛囊再生能力及其影响因素

　　杨燕文综述，亓发芝审校 　　 　　毛囊是调控毛发周期生长的重要结构，呈周期性、有规律地自我再生，在人体内终生不断，是成人有此特征的唯一器官。它对研究上皮与中胚层起源细胞之间的相互作用，器官和组织再生、色素形成、伤口愈合及皮肤癌的发病机制等重要生命过程来说都是极好的模型。毛囊毛发的再生研究不但将给需要毛发移植的患者带来福音，更将对组织工程和细胞再生领域产生极大的影响。本文就毛囊再生的能力及其影响因素综述如下。
　　
　　1　毛囊的再生能力
　　
　　毛囊为围绕毛发的管状囊样结构，由表皮向下凹陷，深入真皮而成。它由上皮成分和真皮成分组成。上皮成分包括内根鞘(inter root sheath,IRS)和外根鞘(outer root sheath，ORS)，真皮成分包括毛乳头(dermal papillae,DP)和真皮鞘(dermal sheath,DS)。毛发的生长经历生长期(anagen)、退化期(catagen)、休止期(telogen)和脱落期(exogen)，并终身不断重复这一循环。
　　1．1　毛囊的体外培养再生：早在1949年，研究者们就从未分化出毛囊的胚胎鼠皮肤培养出一种相似于正常组织发生的毛囊结构。在此基础上，通过将小鼠胚胎皮肤的游离细胞传代于鸡胚绒毛膜尿囊膜上，聚集后的细胞可分化形成毛囊结构。但这种方法培养出的毛囊超过1周就会退化死亡，不利于长时间的观察研究。20世纪80年代，随着细胞培养技术的发展，组织培养技术日趋成熟。Leighton、Hoffman等对有毛皮片进行气液界面培养(即三维培养)，培养的毛发生长与体内过程相似。为毛发生长的体外研究提供了很好的模型，但尚不能对单个毛囊的生长情况进行观察。1990年，Philpott等首先成功地培养了游离的人头皮毛囊。培养毛发的增长速度接近于体内生长速度。但是由于缺少周围组织的影响，它们并不经历完整的毛囊循环，也不再生出新的毛囊。1999年，Michel等将完整的毛囊皮脂腺单位植入由人角质形成细胞(keratinocyte)和成纤维细胞形成的皮肤替代物中，培养出有毛的皮肤替代物，提供了一个排除体内因素影响的毛囊研究模型。2005年，Krugluger等将人毛囊的真皮乳头和外根鞘细胞注入经培养的人耳后皮肤标本，有毳毛样毛发长出，且组织学分析显示皮肤标本里有多个带皮脂腺的小型毛囊。这一实验通过注入细胞获得完整的毛囊及其生长环境，率先为研究毛囊生长分化中的细胞间作用、细胞基质间作用及信号途径等提供了很好的离体模型。
　　1．2　毛囊各段的再生能力：在对整个毛囊体外再生有一定认识后，人们开始对毛囊各部分再生能力进行分析。20世纪60年代，Oliver等进行的研究显示：切除毛囊下1／3，真皮鞘细胞可以转化为毛乳头，毛囊可以再生；切除毛囊下1／2，则毛囊不能再生。1996年，Jahoda等将各种终末期毛囊的基底部去除后植入裸鼠，发现无论是作为移植皮片的附加物，还是直接单个毛囊植入皮下，均有毛发长出，并检测到真皮乳头和毛球结构的形成。显示毛囊在移动后仍有再生其下部分结构的能力。1998年，Raposio等将毛囊在隆突下横断，上下两部分分别植入培养10天，测量10天前后毛囊的生长情况发现：下半部分毛囊的生长长度与完整毛囊的长度无显著差异；而上半部分的则明显短于它们，并在其下部分检测到一个细胞明显增殖的区域，提示在这部分毛囊的底部有乳头的形成。由于观察的时间只是10天，上半部分生长落后的原因可能是需要一段时间来形成新的乳头，然后再开始生长毛发。
　　1．3　毛囊干细胞：毛囊的再生与毛囊干细胞有着密不可分的关系。对毛囊各段再生能力的研究显示，毛囊的中段是维持毛囊周期性生长所不可或缺的。随着标记滞留细胞(label-retaining cell,LRCs)的观察发现，毛囊干细胞被定位于隆突部而不是毛球处。这一隆突激活假说(bulgeactivation hypothesis)被广泛接受并一再被证实。隆突干细胞有很高的增殖和集落生成能力，能分化成表皮、外根鞘、内根鞘、毛干、皮脂腺等结构，高表达整合素β1、α 6(β 1-integrin、α6-integrin)、K19(keratin 19)、CD71、p63以及CD34等标记。但是现有的标记还不能准确区分干细胞及其后代。近来还有研究提示，定位于毛囊上半部分的干细胞远不止标记滞留实验中所发现的那些。虽然只要通过其中的一小部分就可以满足其维持数量恒定的需要，但为何要有这么多干细胞存在，仍不太清楚。Oshima等观察到，当毛发生长停止、毛囊下部进行结构改变时，毛囊的最底部含有大量的集落生成角质形成细胞(clonogenic keratinocyte)，并对形态发生的信号作出反应。这一现象说明多能干细胞迁移至毛囊的底部来生成毛发。暗示了集落生成角质形成细胞与多能干细胞有着极为密切的关系，可能是同一细胞的不同分化阶段。Bernard等在生长期毛囊外根鞘的上、下1／3处发现两个上皮干细胞(epithelial stem cell，ESC)的储存区。这两处在退化期融合，然后在新一轮的生长期重新分离。Ito等在对毛囊干细胞的研究中发现，在休止期的时候，毛囊的最底端是隆突和次级毛芽(secondary hair germ)，这两部分均参与了新一轮生长期毛囊的生长。在退化末期，隆突的最底部崩裂并围绕毛发形成次级毛芽。在生长期的最初6天隆突细胞开始增殖和自我更新。这段时间增殖的隆突细胞也生成了以后形成次级毛芽的细胞。这些研究都提示，毛囊干细胞在生长初期生成某些具有高度增殖能力的细胞，迁移至毛囊的最底部来进行毛囊下部的形成，并在退化期凋亡。
　　值得注意的是，Ito等在实验中发现，在隆突细胞受到脱毛等损伤后，次级毛芽里的祖细胞能重新进入隆突并再次表达已丧失的隆突细胞标记。这一发现支持了角质形成细胞在创伤的影响下可以“去分化”成干细胞状态，也提示这一过程可能与干细胞微环境的信号有关。毛囊干细胞具有自我更新和多向分化的潜能。在体外还能分化成神经元、神经胶质细胞、角质形成细胞和平滑肌细胞。每个毛发生长周期，毛囊干细胞都被激活来再生新的毛囊。它们可以在体外被培养，并自我更新或是在移植后形成新的毛囊和上皮。Moms等用K15-EGFP(enhanced green fluorescentprotein)标记来观察隆突细胞的实验显示，成熟小鼠的隆突细胞在正常的毛囊周期中可以再生毛发中的所有上皮细胞类型。毛囊干细胞能再生毛囊已经得到公认，但是有关它是否生成了新的上皮，却受到质疑。大多数学者认为它也形成了毛囊间的上皮。但仍有学者不同意这一观点，他们认为毛囊隆突处的干细胞在没有创伤的情况下，既不是上皮的干 细胞，也不是上皮干细胞的来源。上皮、毛囊和皮脂腺可能有其各自不同的干细胞。
　　1．4　不同时期毛囊的再生能力：Robinson等的实验表明，位于不同时期的毛囊被取出在体外培养时，它们的生长能力是不一样的。生长早期的毛囊以每天至少3mm持续15天以上的速度长出纤细的毛发纤维；而在生长末期的毛囊在较短的时间内长出较粗的纤维，然后就停止生长了；生长中期的毛囊特性则居于两者之间。所以对于毛囊生长的体外观察，应尽量取位于同一时期的毛囊来进行培养研究，以使结果更具可靠性。Philpott等用啮齿类的毛发生长周期是同步的这一特性，证明了毛囊在取出体外进行培养后，仍维持它原有的生长活性，与留在体内同样的毛囊生长是一致的，且生长VI期的毛囊长度达到最长。最近的研究再次证明了毛囊在体外的生长情况同在体内时所处的时期有关。Kwon等指出，某些体外实验结果同体内的不符，很可能是因为选取了不恰当时期的毛囊来作为研究对象。这一研究还提供了一种“毛发漂色(hair-bleaching)”的方法，通过测量自表皮表面到漂色与未漂色分界处的距离，来显示毛干在某段时间内生长的确切长度。建议用此方法或是结合测量自表皮表面到真皮乳头底部的毛囊长度，来选取同一时期的毛发，以使实验结果更准确一致。
　　
　　2　影响毛囊再生的因素
　　
　　毛囊再生的研究有其独特魅力，不光是因为它有周期性自我更新的能力，很大程度上也因为它包含了多种不同类型的细胞，在小小的生命循环中展现了细胞与细胞以及组织间相互影响的基本规律。
　　2．1　上皮一间质间的相互作用：毛囊的生长需要真皮成分和上皮成分的相互作用才能协同完成(dermal-epidermalinteractions／epithelial-mesenchymal interactions)。一些皮肤肿瘤的发生往往与异常的上皮一问质问作用有关。
　　2．1．1　真皮乳头的作用：真皮乳头细胞(dermal papilla cells，DPC)对诱导新生毛囊和上皮的产生和分化有不可或缺的作用。有实验表明，培养过的上皮细胞或其他上皮，如角膜上皮、羊膜等，如果和有诱导作用的真皮细胞一块培养，也有生长出毛囊的能力。DPC来源于发育时毛囊的间充质浓集处(condensed mesenchyme)，是一种具有高度特异性的细胞群。研究显示，DP是多种信号的中心，在毛囊的形成和再生中起重要的诱导作用。毛囊的大小和毛发的粗细都决定于DP的体积，而DP的体积与DPC数量和单个细胞的体积有关。DP对上皮的诱导能力不会因为培养而丢失，且不受种属不同的限制。Wnt家族对维持培养DPC的诱导能力起一定作用。
　　早在20世纪90年代初，Jahoda等在一定的条件下，将单纯的培养过的体毛(pelage)毛囊DPC植入足底皮肤垫后，新的体毛样毛囊和纤维可以被诱导出来，充分说明了DPC的诱导能力。他们还在动物试验中将毛乳头植入切除了毛球部的毛囊，可以形成新的毛球部，毛囊由休止期转入了生长期。很好地确定了成熟鼠触须毛囊DP对毛囊生长的诱导作用，但对毛囊上皮和真皮细胞的影响，以及其他类型的毛囊中DPC的作用还远不清楚。为了解决这些问题，Jahoda等用人的毛乳头来诱导横断后的鼠触须毛囊。发现真皮对上皮的诱导作用要在与上皮接触的情况下才能发生，但是简单地将上皮细胞堆在真皮细胞上面是不能诱发生长的。说明毛囊内的三维结构对毛发的生长有一定的影响。用人类的DP或是鼠类的DP作用于鼠的上皮，诱导上皮长出毛发的时间是基本一致的，这从某种程度上反映了上皮成分对真皮成分的作用。Moll在拔出毛囊(plucked hair follicle)体外分段培养的实验中显示：ORS中上部有较强的增殖能力，而毛球区却几乎没有增殖。这与体内的情况很不一样，可能是因为毛球区失去了DP的作用，而ORS中上部在体内可能受到某些因子的抑制作用。同时，ORS的角质形成细胞，在上述实验中向上皮分化，而在DPC存在的情况下，则向毛囊分化。也充分证明了DPC在诱导毛囊分化生长中的重要作用。
　　2．1．2　其他真皮成分的作用：真皮鞘细胞(dermal sheathcells，DSC)是另一类重要的真皮细胞。它在胚胎发生、形态学和生物学特征上与DPC紧密相关。1992年，Horne等将毛囊横断去除下半部分，并植入含有下半部分真皮鞘细胞(dermal sheath cells，DSC)的材料里，超过60％的毛囊长出粗壮的触须纤维。显示在毛囊上半部分的协同下，下半部分的DSCs有替代DPCs的能力。Matsuzaki等将胡须毛囊的上半部分横断后植入肾包膜内，8周后也生长出了皮毛型的毛发和毛球(pelage-like hair-producing bulb)，提示上半部分真皮鞘也有较弱的诱导毛发再生的能力。
　　1999年，Reynolds等的一项实验引起了广泛的关注。他们将一名男士头皮毛囊的DP和DS植入一名女士的前臂，通过检测细胞内的DNA来进行观察。3～5周后，粗大的新毛发在移植区长了出来，明显不同于前臂细小的毛发。检测发现新毛囊的DPC来自于男士，而其他部分则来自于女士。整个过程中没有明显的排异反应产生。这一实验充分显示了毛囊真皮成分诱导毛囊形成的能力及其特殊的免疫状态，也为各成分作用的观察提供了一种很好的实验检测方法。2003年，McElwee等对DP细胞及真皮鞘杯(dermal sheath“cup”，“DSC”)细胞进行实验研究，提出培养过的DP和“DSC”细胞对毛囊的诱导能力是相同的，而非球部的DS细胞则无此诱导能力。并推测“DSC”可能是DP细胞的来源，通过迁移形成DP。最近，Inamatsu等对可能是DPC胚胎时发源处的真皮浓集区(dermal condensations，DC)进行研究。分别用含有真皮浓集区的胚胎真皮和经培养的DPC来诱导成熟的无毛上皮中毛发的产生。前者诱导过程中可以观察到基板样结构(placode-like tissues)，而后者虽然也形成毛囊，但无此结构产生。这一现象说明成熟的上皮细胞在DC的作用下重现胚胎时期毛囊的发育过程，在DP的作用下直接进入毛囊的生长期。
　　2．1．3　上皮成分的作用：在上述提及的真皮一上皮间相互作用的研究中，上皮对真皮的作用也被多次指出。此外，1996年，Reynolds等分别将毛囊的上皮发生细胞(germinativecells)、ORS细胞和皮肤基底细胞，同没有诱导功能的真皮细胞(多次传代的乳头细胞、低传代根鞘细胞和成纤维细胞)一起植入小的耳部皮肤伤口。结果在发生细胞和乳头细胞、发生细胞和根鞘细胞的组合中，诱导出了大的胡须型(vibrissa-type)毛囊和纤维。证明了发生细胞有使无诱导性的真皮细胞具备诱导性，并诱导出新毛囊的能力。显示了上皮 成分对真皮成分发挥诱导能力的作用。
　　2．2　信号途径：毛囊在正常情况下，不断进行生长、退化、脱落这一循环，维持稳定的毛囊周期。而在受到外界因素的影响时，又会表现出相应的改变，这些都是通过各种信号途径来调控实现的。研究表明，毛囊周期的调控可能和大量的信号途径有关。虽然对信号分子的研究很多，也不断有新进展，但整个控制过程还是没有完全搞明白。米诺地尔(minoxidil)、环保霉素A(cyclosporin A)、FK506、阿糖胞苷、去甲肾上腺素(norepinephrine-depleting agent)、雌激素受体拮抗剂(estrogen receptor antagonist)、肿瘤促进剂(tumor promoter agent，TPA)、类视黄醇(retinoid)、上皮形成素(epimorphin)及多种生长因子和神经介质，如KGF、HGF、EGF、VEGF、TGF-α、TGF-β、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、shh、P物质(substance P)、BMP、Vit D、MMP、BDNF、PKA、神经营养因子(neurotrophin)等，都被证明参与了毛发周期的调控。
　　
　　3　问题与展望
　　
　　当前，毛囊再生的研究热点涵盖了现代生物学的主要问题，如器官发生、干细胞生物学、上皮一间质间作用、形成模式、器官周期性变化以及细胞分化等，很多研究结果都有很好的临床应用前景。其中对毛囊干细胞的研究不仅为皮肤生物学、上皮一间质间作用等提供了实验模型，也使基因和干细胞治疗的发展成为可能，已有实验将脂质体和病毒载体等递药系统用于基因治疗。此外，皮肤和毛囊干细胞不仅可以被诱导分化成表皮和毛囊角质形成细胞，而且在特定条件下还能被诱导分化成其他组织，如成骨细胞、软骨组织、肌肉和神经细胞。若研究出能在临床上将这些毛囊干细胞转化为其他组织，这种来源充沛、取材容易的干细胞将有可能用于治疗其他功能性衰竭疾病。而干细胞原位的激活和动员，也为上皮、真皮及皮肤附属器的更新和修复展现了一条新的理想途径。
　　目前，临床上开展的毛发移植术都是通过自体毛发来移植的，存在一定的缺憾。毕竟人体本身的毛发数量有限，还有一些秃发患者，呈女性型秃发，即表现为全头部毛发普遍稀疏伴顶部稀少的特征。这类患者由于供区条件差，因此大多无法接受手术治疗。对毛囊体外再生的研究有望解决这一难题。取患者自体毛囊细胞体外扩增后移植，可以克服供区有限的不足。不过此项技术虽然已经有了很好的实验室和动物实验基础，但在人类身上的应用仍然存在问题。譬如：什么类型的细胞用来分离培养是最理想的?如何在体外培养过程中保持细胞的可诱导性?有没有更为简便的提取毛囊细胞的方式以及相关的经济效益等问题都还没有很好地解决，要在临床上常规开展这一技术还有待进一步的努力。而前文提到的Reynolds等的实验也为同种异体毛囊细胞的移植提供了很好的范例。
　　总之，毛囊再生的研究已历时多年，位于隆突处的干细胞的分化、增殖及迁移对毛囊的再生起着重要的作用。毛囊的生长有着其特定的周期性，上皮一真皮间的相互作用是其生长和循环不可或缺的部分，各种信号途径在毛囊周期的调控中发挥着各自的作用。如何繁殖培养毛囊干细胞，并使其分化成完整的毛发皮脂腺单位；定位所有对毛发生长有重要作用的基因；阐明毛囊周期生物钟各个环节的情况；了解更多毛囊周期中的信号途径及其作用机制，是一些有待解决的问题。
　　
　　[收稿日期]2006-10-17　[修回日期]2006-12-06
　　编辑／李阳利
　　
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