人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子纳米缓释剂对成纤维细胞的影响 表皮生长因子与成纤维细胞生长因子

　　作者：隋继强，韩岩，吴红，郑岩，易成刚，郭树忠 　　[摘]目的：制备碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)可降解缓释微球，考察其生物活性的保存情况，以及它们对成纤维细胞的作用。方法：采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF、EGF的明胶缓释微球，将它们加入成纤维细胞的培养液中，用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)测定细胞增殖情况。结果：复合bFGF、EGF的缓释微球平均粒径(11．32±3．64)μm；培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性；5天后，两种生长因子缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组；7天后，两种生长因子缓释微球组值仍高于其它组，但差异无显著性。结论：复合bFGF、EGF的缓释微球制备工艺简便，成球性好；能较长时间地持续释放活性bFGF、EGF，可促进成纤维细胞的增殖。
　　[关键词]成纤维细胞生长因子；人表皮生长因子；微球体；明胶；成纤维细胞；缓释制剂
　　[中图分类号]R813 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(206)12-1342-04
　　基金项目：陕西省自然基金(编号：434512201)
　　通讯作者：郭树忠，教授，博士研究生导师，主任医师；
　　E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn
　　
　　人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的应用研究一直是创面治疗领域最活跃的课题之一。但是，bFGF在体内的半衰期仅为3-10min，全身或局部应用的效果不能满足临床应用需要。表皮生长因子的变异性蛋白质二级空间结构限制了其内在的生物功能特性，而且局部使用的表皮生长因子类制剂在接触皮肤创面的数分钟内就可被创面渗出液中的蛋白酶降解破坏，被降解的小分子肽又可在创面引起明显的局部炎性反应，所以在临床应用中难以发挥促进上皮增殖的作用。因此，有学者开始研究bFGF微球等缓释制剂的类似作用。经检索文献，目前国内只有bFGF缓释制剂、EGF缓释制剂及其相关实验研究的报道，而未见到bFGF、EGF两种生长因子缓释制剂合用对创面治疗相关实验研究的报道。bFGF、EGF制备成纳米缓释剂后，其生物活性的保存情况是衡量微球质量的一项重要指标。因此，我们将bFGF、EGF两种生长因子缓释制剂加入成纤维细胞培养液中，采用细胞计数法、细胞活力检测法和细胞周期分析法，考察纳米缓释剂中bFGF、EGF两种生长因子生物活性的保存情况，并观察缓释bFGF、EGF对成纤维细胞的作用。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1试剂与设备：bFGF冻干粉剂、EGF(珠海亿胜生物制剂有限公司)、DMEM复合培养液(美国Gileco公司)、明胶(等电点50，相对分了量99000，美国Sigma公司)、Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)、噻唑蓝(美国Sigma公司)、美国Bio-RAD Model 550酶标分析仪、美国Elite SP型流式细胞仪、日本H600．1V型透射电镜、美国FJ-2003型计数仪。自制bFGF-明胶微球、EGF-明胶微球。人bFGF定量ELLSA试剂盒(QuantiKineR，R&Dsystems)，250g／L戊二醛、丙酮、异丙醇、无水乙醚、液体石蜡、氨基乙酸为国产分析纯，Span-80(美国Sigma公司)为进口分析纯，水为双叹蒸水，JJ21型精确电子搅拌仪，TGL216G高速离心机，GENESIS冻干机(Virtis公司)，BX241数码显微镜(Olympus)。
　　
　　1．2方法
　　1．2．1 bFGF-明胶微球的制备：将含有10g／L Span-80的液体石蜡30ml置于三口瓶中预热至55℃，快速搅拌下滴加入同样温度的明胶水溶液4ml，并调节搅拌速度至450r／min,继续搅拌10min；形成油包水乳剂后迅速改冰浴，继续搅拌10min,使其完全固化：加入250g／L戊二醛0．1ml,搅拌下预固化2h，4℃固化24h,用适量丙酮、异丙醇、乙醚洗涤，挥去乙醚，真空干燥，得淡黄色粉末状微球。继续用双蒸水洗涤，至有机溶剂洗净，冻干。将200μl的bFGF溶液滴加在20mg的冻干明胶微球上，在室温下保持30min以使bFGF完全融入微球。60Co照射灭菌封存。将含有bFGF的微球样本置于光镜下，观察其外形及分散度。同时测量500个微球的直径计算其平均粒径。以算术平均径为微球的平均粒径，计算公式为：平均粒径=n1 d1+n2 d2+…+nn dn／n1+n2+n3+…+nn。式中n1，n2…nn为粒子数；d1，d2…dn为粒径。
　　1．2．2 EGF-明胶微球的制备(同1．2．1)
　　1．3成纤维细胞的培养和实验分组：标本取自手术剩余的健康全厚皮，剪去皮下和真皮深层组织，置2．0mg／L Dispase酶内4℃消化16h，剥离表皮放入37℃浓度为0．25％胰酶+EDTA的等量混合液中，消化5min，用含10％胎牛血清的DMEM终止胰蛋白酶作用。吸管吹散组织块以获取单个成纤维细胞。将悬浮细胞接种于25ml培养瓶，细胞密度为5×105／瓶，置37℃，5％CO2孵箱培养。待细胞融合成单层后再传代培养备用。实验分为四组：A组培养液为含体积分数10％小牛血清+20 ng／ml EGF、bFGF纳米缓释剂的DMEM；B组培养液为含体积分数10％小牛血清+20ng／mlEGF纳米缓释剂的DMEM；C组培养液为体积分数10％胎牛血清+20ng／mlbFGF纳米缓释剂的DMEM；D组培养液为体积分数10％胎牛血清+与A组等量的空白微球的DMEM(空白对照组)。
　　1．4缓释EGF、bFGF微球对成纤维细胞数量的影响：取第2代培养的成纤维细胞，以1×107／L接种于24孔板，使细胞同步生长后按实验分组换成不同的培养液分别于培养1、3、5、7天收集细胞，每个时相点设4个重复测量孔，用血球计数板计数。实验重复5次。
　　1．5缓释EGF、bFGF微球对成纤维细胞活力的影响[四甲基偶氮唑盐做反比色法(MTT法)：取第2代培养的成纤维细胞，以2×107／L密度接种到96孔板，每孔200μl，使细胞同步生长后按实验分组换成不同的培养液。分别于培养1、3、5、7天按常规先后加入四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜，每个时相点设4个重复测量孔，用酶标分析仪依次检测每孔吸光度(A)值，检测波长为570nm。实验重复5次。
　　1．6缓释EGF、bFGF微球对成纤维细胞周期的影响：取第2代培养的成纤维细胞，以2×107／L密度接种到6孔板，每孔2ml。每组分别设1、3、7天3个时相点，每个时相点设4个重复测量孔，用ElitesP型流式细胞仪检测细胞分裂周期， 计算G2／M+S期百分数。
　　1．7统计学分析：结果以x±s表示：采用SPASS 10．0软件包进行统计分析和处理，四组均数间的比较采用t检验，多组均数间的比较采用单向方差分析(One-way ANOVA)。以ρ＜0．05为差异有显著性意义。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1 bFGF-明胶微球、EGF-明胶微球的表观及平均粒径：光镜及扫描电镜观察可见制备的复合bFGF、EGF缓释微球呈圆球体，球体均匀度好，大小较均匀。干燥状态的微球表面有少许颗粒状吸附物，但未见微孔和裂纹，图(1～6，见中插1)。在扫描电镜下测得微球粒径呈正态分布，大部分为10～28μm，占89．6％，平均粒径为(11．32±3．64)μm。冻干粉剂为淡黄色疏松粉末，无塌陷或萎缩现象；加双蒸水后为淡黄色乳状溶液，再分散性良好(如图)。
　　2．2缓释EGF、bFGF微球对成纤维细胞数量的影响：各组计数结果见表1。培养1天后，各组成纤维细胞数差异均无显著性(F检验，ρ＞0．05)；3天时，各组成纤维细胞数比较：C组＞A组＞B组＞D对照组，但A、B两组间差异无显著性(q检验，ρ＞0．05)；培养5天后，缓释微球A组细胞计数明显高于对照组(q检验，ρ＞0．05)；7天后，A组值仍比其他组高，组间差异与5天时相仿。
　　
　　2．3缓释EGF、bFGF微球对成纤维细胞活力的影响：各组成纤维细胞A值的检测结果见表2，培养1天后，各组A值间差异无显著性(F检验，ρ＞0．05)；3天时，各组A值比较：A组＞C组＞B组＞D组，但前两组间差异无显著性(q检验，ρ＞P>0．05)；培养5天后，各组A值依次为：A组＞C组＞B组＞D组，缓释微球组A值明显高于对照组(q检验，ρ＜0．05)；7天后，各组A值问差异与5天时相仿。
　　
　　2．4缓释BFGF微球对成纤维细胞周期的影响：由表3可见，各组成纤维细胞的细胞周期检测结果显示：培养1天时，C组G2／M+S期百分数高于A和B微球组，差异有显著性意义(q检验，ρ＜0．05)；培养3天、7天时，A组G2M+S期百分数高于B和C微球组，差异有显著性意义(q检验，ρ＜0．05)。
　　
　　
　　3　讨论
　　
　　bFGF是一种具有广谱作用的多肽因子，其细胞学效应包括：有丝分裂原、形态发生因子、趋化作用等。EGF是一种强力的细胞分裂促进因子，能促进细胞增殖、上皮再生和迁移以及血管形成；同时EGF还能刺激上皮细胞合成分泌胶原、透明质酸等细胞基质，促进结缔组织细胞的生长。目前国内文献中尚未见到有关人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)纳米缓释剂的制备及其在慢性创面治疗中的应用研究报道。
　　表皮生长因子(EGF)促进愈合作用的机制主要包括两个方面：一是EGF作为强有力的趋化因子，能促进角质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等向受伤部位迁移；二是EGF作为有丝分裂原，可促进上述细胞的增殖。深二度烫伤创面的愈合涉及肉芽组织支架的形成和表皮细胞的修复。表皮生长因子(EGF)为有丝分裂刺激原，可以加快细胞分裂，促进增殖，还可改变细胞的趋化性，增加细胞迁移。
　　碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的促修复作用是直接作用于其靶细胞(成纤维细胞与血管内皮细胞等)上特异性受体，并通过促分裂效应使这些细胞发生分裂增殖，进而启动并加速修复进程。在皮肤创伤模型中，应用bFGF显示了肉芽组织沉积增加，并伴随着大量的多血管现象。bFGF促进了毛细血管增生，从而改善了局部微循环及组织营养状况，肉芽组织迅速生长，创缘上皮向中心迅速爬行，促使创面愈合。
　　表皮生长因子亦为近年来的关注热点，人们试图通过上皮始祖细胞增殖的诱导作用促进皮肤创面的愈合，但实际效果受到了多种因素的限制。EGF促进肉芽组织生长和伤口愈合的作用已得到了广泛的认可，但由于EGF是一种蛋白质性生长因子，如将其直接用于伤口可被组织中的蛋白酶分解，不能发挥持久作用。因此探讨安全高效的EGF给药方式，成为一个重要的研究内容。纳米微囊包裹非病毒载体基因转移技术是Kim Leong等人于1998年建立的，该技术较脂质体转染方法具有更优越的基因转移效率。纳米微囊包裹可避免转载物在受体内被溶酶体酶降解，同时由于采用可降解生物材料包裹，故能显著提高转载基因的活性并具有长时间缓释功能。由于以上优点，利用EGF纳米微球治疗伤口愈合已成为一种重要的手段。彭湃等研究将纳米微囊包裹重组质粒DNA真核表达载体pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF应用于创面后，其肉芽组织的生长明显快于生理盐水对照组，表明纳米微囊包裹的重组VEGF基因内表达载体能在创面周围稳定地释放VEGF，促进新生血管的形成，加快伤口愈合。为本研究提供了一定的理论依据。
　　目前应用bFGF、EGF的主要困难是给药途径。缓释微球载体作为新型药物缓释控释系统之一，具有许多优越性，可缓释药物、靶向输送、在保证药物治疗作用的前提下减少给药剂量以及降低药物毒性等。明胶属于天然高分子生物材料，通常从动物胶原经水解提炼，在水中久浸可吸水膨胀或软化，机体内组织相容性好，能被组织吸收。明胶在未吸水前耐高温，可高温消毒；吸水膨胀软化后，溶点也不超过30℃。此外，明胶还具有价廉易得、无抗原性、摩擦系数低、在体内可自然降解等优点，已广泛用于多种药物剂型中。明胶是氨基酸与肽类交联形成的直链聚合物，能进行多种表面修饰及反应，制备时可根据不同要求设计。而且，明胶微球为实体微粒，被包裹药物释放相对缓慢，足以达到缓释的要求。明胶微球最大优点是对碱性和酸性生长因子都能包裹。
　　微球制备采用改良的乳化冷凝法，其机制是等电点为5．0的酸性明胶在水中溶解后，分子伸展为纤维状，在冷冻脱水的条件下卷曲，并由多个分子凝聚成球状微粒，在固化剂(戊二醛)的作用下，明胶分子呈稳定性良好的三维网状结构，并与荷电性相反的碱性bFGF通过离子间的相互作用形成较为稳定的PECs，两者间形成一定的亲和力，bFGF被明胶吸附并包裹于微球中，随着明胶的降解，实现bFGF在体内的控制释放。我们经过多次试验，对旧工艺作了改进。为克服以往技术制备的微球在水性环境中溶解速度较快的缺点，采用交联固化手段延缓生长因子的释放。在制备过程中对微球进行预固化，提高微球的成形率。本实验采用戊二醛作固化剂，在中性介质中将微球交联。为避免固化后粘连，选择异丙醇环境，固化好后用2％氨基乙酸洗涤过量戊二醛，再用异丙醇和乙醚洗。此方法固化所得微球外形圆整，分散性好，包封率较高。此外，采用多级滤网可以将缓释微球按要求筛分为一定直径的产品，满足微球与不同孔隙率的组织工程支架结合的需要。
　　复合bFGF、EGF缓释微球对成纤维细胞数量和活力影响的实验结果是：培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性；5天后，复合缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组；7天后，复合缓释微球组值仍高于其他组但差异无显著性。表明使用bFGF、EGF的最初24h无明显作用；培养初期，bFGF组、EGF组中游离的bFGF、EGF数量多于复合缓释微球组释放的bFGF、EGF，所以，bFGF组促分裂作用最强；培养5天后，bFGF组及EGF组的大部分游离bFGF、EGF失去活性，而缓释微球组持续释放具有生物活性的bFGF、EGF，因此，后者的促分裂作用最强：培养7天后，虽然缓释微球组仍在释放bFGF、EGF，但速度已经减慢，而最初释出的部分bFGF、EGF生物活性受到了破坏，因此各组之间的促分裂作用无显著差异。空白对照组的结果也显示，微球成分对成纤维细胞数量和活力无影响。因此，本研究证明了复合bFGF、EGF缓释微球对成纤维细胞数量和活力的影响明显优于对照组。我们认为，应进一步实验以证明能否通过改变明胶微球的粒径来延长或缩短微球的降解时间及BFGF、EGF的释放速率，以期更好地满足长时期内促成纤维细胞增殖的需要。
　　我们经过多次试验，克服了以往技术制备的微球在水性环境中溶解速度较快的缺点，采用交联固化手段延缓生长因子的释放。复合bFGF、EGF缓释微球对成纤维细胞数量和活力影响的实验结果是下一步进行动物实验的重要基础和依据。
　　
　　[收稿日期]2006-09-20　[修回日期]2006-11-28
　　编辑／张惠娟
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。