【大鼠脂肪干细胞（ｒＡＤＳＣｓ）转运ＶＥＧＦ基因促进随意皮瓣成活率的研究】SD大鼠脂肪干细胞干性鉴定

　　鲁开化　赵京禹　孙同柱　韩　冰　陈　伟 　　[摘要]目的：探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠脂肪干细胞(rADSCs)的稳定表达系统对皮瓣成活的影响。方法：①培养和鉴定大鼠ADSCs，脂质体介导pcDNA3．1－VEGF165质粒转染大鼠(rADSCs)，经G418筛选抗性rADSCs并继续培养4周，用ELISA法检测转染后细胞培养上清中VEGF浓度。②Brdu标记被转染rADSCs后，在大鼠背部制备8．0cm×2．5cm的随意型皮�模型，实验组(10只大鼠)为注射pcDNA3．1-VEGF165质粒转染的rADSCs悬液到大鼠腹腔，对照组(8只大鼠)为注射2ml被空载体pcDNA3．1(一)转染的rADSCs悬液，术后7天用透明纸描记法记录皮瓣成活范围，记数坐标纸格子并换算为成活面积百分率。分别于术后3天、5天、7天在成活皮瓣的远端切取皮瓣组织标本行免疫组化染色。结果：①ELISA检测4株转染和经G418筛选抗性并继续培养2周的第二代rADSCs上清中VEGF浓度多达(4．21±0．35)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=4)，有2株细胞培养液上清分泌VEGF较强，其余2株细胞相对较弱，均大于对照的空载体转染组和未转染组rADSCs培养液上清中的(0．49±0．15)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=3)和(0．61±0．86)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=3)，均P2培养箱、台式离心机(LingLi公司)、Calibur型四色流式细胞仪(美国Becton Dickinson)、DMIRB型倒置相差显微镜(德国Leica公司)。
　　1．2方法
　　1．2．1 rADSCs的分离和原代培养：SD大鼠麻醉后，在无菌下切取腹股沟脂肪垫，剪碎后加入0．1％Ⅰ型胶原酶消化40～60min，加入2倍体积的D-Hank’s液，离心收集沉淀并用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释，转种到培养瓶中。
　　1．2．2 rADSCs的鉴定：收集处于对数生长期的第2代rADSCs，95％乙醇固定和漂洗后分别加入鼠抗鼠的CD49天单克隆抗体，4℃过夜，PBS洗掉未结合的抗体，加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠二抗，室温下放置30min，PBS洗掉未结合的抗体。用流式细胞仪检测。同时用PBS／FBS／NANO3代替一抗作为空白对照。
　　1．2．3脂质体介导VEGF转染rADSCs：生长到70％～80％融合的细胞，用新鲜无血清DMEM培养基洗涤2遍。按LipofectamineTM2000操作说明，pcDNA3．1(一)、pcDNA3．1－VEGF165质粒分别8．0μg和LipofectamineTM2000 20μl混合，室温静置20min后，加入1ml不含血清的DMEM培养基，37℃、转染rADSCs 8h后，换成含血清的DMEM培养基继续培养24h，换成最小致死剂量0．5g/L的G418选择培养基，抗性细胞筛选，2周后细胞克隆形成，其阳性克隆在0．5g/L的G418维持剂量压力下继续扩大培养2周备用。
　　1．2．4 ELISA检测被转染rADSCs上清中VEGF浓度：各组rADSCs在培养24h后收集培养上清，用ELISA试剂盒检测培养上清中VEGF浓度，以平均pmol／1×106细胞／48h(x±s，n＝4)表示。
　　1．2．5被转染rADSCs的标记：在传代后的细胞培养液中加入新鲜配制的Brdu，终浓度5μg/m1，至细胞生长到95％以上融合后备用。接种在12孔板中的rADSCs在用Brdu标记后经抗Brdu单抗进行免疫细胞化学染色，随机观察5个视野并计数。
　　1．2．6动物实验：消化收集标记Brdu的rADSCs并台盼蓝染色记数为1×1077／ml，用D-Hank’s液反复3次洗涤，制成2ml的rADSCs的单细胞悬液用于注射动物模型。在大鼠背部一侧制备直径8×2．5cm的背部随意型皮瓣模型，掀起皮�后保留皮下的肉膜。实验组有10只大鼠，在每只大鼠腹腔内注射2ml被转染的rADSCs单细胞悬液，对照组有8只大鼠，在每只大鼠腹腔内注射2ml被空载体pcDNA3．1(一)转染的rADSCs单细胞悬液。分别于术后7天用透明纸描记法记录皮瓣成活范围，用数坐标纸格子数的方法计算成活面积并换算为成活百分率。术后3天在皮�远端切取全层皮肤组织标本并用4％的多聚甲醛固定1h，然后用80％到100％的系列梯度的乙醇脱水，石蜡包埋后切片，行HE染色和抗Brdu免疫组化染色。
　　1．2．7统计分析：数据用x±s表示，t检验。
　　
　　 　　
　　2　结果
　　
　　2．1 rADSCs的分离和培养以及鉴定：原代培养的rADSCs在贴壁后细胞形态均一，呈梭形的单层成纤维细胞样。流式细胞学检查示第3代rADSCs均一性较好，CD49天阳性率为95．3％。
　　2．2细胞转染与筛选效果：经转染和G418筛选后，非转染组的和pcDNA3．1(一)空载体转染组的细胞100％死亡，而pcDNA3．1－VEGFl65重组质粒转染组的细胞在筛选约2周后有数量较多的细胞集落，提示克隆化基因的细胞转染及G418筛选效果良好。
　　2．3 ELISA检测转染后细胞上清中VEGF浓度
　　
　　2．4动物实验中大白鼠在手术后生命体征平稳，精神好，进食和饮水均好。术后7天，各组皮瓣的成活面积如下(表3、图1)，术后3天皮瓣远端皮肤组织抗Brdu免疫组化染色(图2)。
　　
　　3　讨论
　　
　　脂肪组织的基质成分中含有具有自我更新和多能分化潜能的脂肪干细胞(adipose derived stemcells，ADSCs)，我们以往的研究结果表明脂肪组织可以促进皮肤创面的愈合。由于脂肪组织来源广泛，取材方便，可以获得的基质细胞数量大，所以可以作为替换MSC来源的成体干细胞。ADSCs和MSC之间CD标记的区别是ADSCs表达CD49天，本实验通过流式细胞学对培养的rADSCs表面抗原CD49天阳性的检测确证和鉴定了培养的细胞是ADSCs。
　　pcDNA3．1－VEGFl65重组质粒转染组的细胞经G418筛选后出现数量较多的细胞集落，而非转染组的细胞100％死亡，提示VEGF基因转染细胞的效果和G418筛选细胞的效果都良好。ELISA检测转染后细胞上清中VEGFl65浓度随时间而升高，而非转染组和pcDNA3．1(一)空载体转染组的细胞上清中VEGFl65浓度较低，提示VEGF165在rADSCs中有效表达，并被正确修饰，rADSCs可以作为基因治疗中的载体细胞。因此，理论上可以将获得的稳定表达VEGF165的rADSCs移植到体内实施基因治疗。
　　Brdu是常用的一种标记细胞核的荧光染料。注入到腹腔的被转染rADSCs的Brdu标记细胞阳性效率可达70％以上，台酚蓝染色记数注入到腹腔rADSCs为1×107，较高的Brdu标记率和充足的细胞数量是rADSCs在本移植实验研究中作为皮瓣基因治疗载体细胞的前提。
　　随意型皮瓣是常用于研究皮瓣成活能力的模型。本实验选用大鼠背部的8cm×2．5cm随意型皮瓣模型，皮瓣远端由于超出长：宽＝1：1．5的比值范围，因而是血流供应较少的部位，在手术后局部出现血流缓慢，内皮细胞缺氧脱落和血栓形成等一系列的病理生理学改变，最终导致远端超出血流供应范围皮�的缺血坏死。本研究结果表明，实验组皮瓣的成活面积(59．6±0．52)％，大于对照组的皮�成活面积(40．5±0．27)％，P