以冻干骨为平台重建组织工程化关节软骨的研究|组织工程软骨

　　[摘要]目的：探索在兔冻干异体骨关节平台上利用组织工程的方法再造人工关节软骨的可行性。方法：实验分成四组，运用组织工程方法将不同构成的同种异体兔软骨细胞-支架材料复合物种植于兔冻干异体骨关节平台上，植入实验兔体内，3月后取材观察体内成软骨情况。结果：仅种植兔软骨细胞的冻干骨关节支架上未见新生软骨形成。粘合有种植兔软骨细胞的PLGA膜片的冻干骨支架关节腔内见新生类软骨样物出现。自体软骨层孔洞缺损模型使用软骨细胞-PLGA膜片复合物可修复软骨缺损。结论: 软骨细胞-PLGA膜片复合物实验动物关节内可形成软骨样物；但在冻干骨关节平台上尚不能形成有功能意义的关节软骨层。
　　[关键词]冻干骨； 聚羟基乙酸聚乳酸共聚物； 组织工程； 软骨
　　[中图分类号]Q819[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）10-1337-03
　　
　　Experimental study of the articular cartilage regeneration on the surface of the freeze-dried bone joint
　　WANG Yong-chun,SHEN Zun-li,SHEN Hua,QIAN Jun,ZHANG Zhao-feng,JIA Wan-xin,CAI Yan-xian
　　(Department of Plastic Surgery,Affiliated First People"s Hospital of Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200080,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of new cartilage formation on the surface of a freeze-dried bone joint by tissue engineering approach.MethodsThe chondrocytes-scafford constructs by tissue engineering were implanted into the rabbit joint defects. Samples were harvested 3 months post implantation to detect the cartilage formation.ResultsNew cartilage-like tissue can be seen on the surface of cell-PLGA constructs, however, it can not be found on the freeze-dried bone joint with only cell seeded. The defects of articular cartilage hole-model can be repaired with cell-PGLA chaff constructs.ConclusionAlthough chondrocytes-PLGA chaff constructs can be used in cartilage tissue engineering, they can not produce functional articular cartilage on the surface of the freeze-dried bone joint.
　　Key words: freeze-dried bone; PLGA; tissue engineering; cartilage
　　
　　骨关节软骨面的完好对关节功能的正常发挥有重要意义。经冻干消毒处理的同种异体冻干骨移植后经爬行替代作用可逐渐被自体骨取代[1]，但同种异体冻干关节软骨组织冻干处理后软骨细胞已基本灭活，移植后软骨面会破坏吸收融合，无法供患者长期使用。我科室自20世纪80年代开始应用冻干异体骨关节加拇甲瓣法再造手指280余例[2]，术后经长期随访摄片观察发现异体冻干骨可通过爬行替代作用逐渐被自体骨取代；而异体冻干关节软骨大多破坏吸收[3-5]，致使再造指关节功能大多丧失，再造手指的功能受限，故此种方法一直得不到有效的临床推广。笔者设想应用组织工程方法将软骨种子细胞种植于同种异体冻干骨平台上，植入实验动物体内观察能否形成关节软骨样结构，探讨这一方法的可行性。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 实验材料:3月龄日本大耳白兔40只及2周龄日本大耳白兔幼兔4只，雌雄不限（复旦大学动物实验中心提供）。胰蛋白酶、II型胶原酶及DMEM培养基购自GIBCO公司。PLGA膜片购自Synthecon公司（连峰硕士惠赠）。兔抗II型胶原多克隆抗体和生物素标记的羊抗兔 IgG购自武汉博士德。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 冻干骨关节的制备和PLGA膜片的粘合：供体兔过量麻醉处死，取兔前足趾骨关节头48个，其中10个截除关节面软骨层，加工制成冻干骨关节[6]后环氧乙烷消毒塑料袋密封常温保存备用。PLGA膜用0.01%多聚赖氨酸中浸泡处理，裁剪成4mm×4mm大小膜片，取完整冻干骨关节及截除软骨层冻干骨关节各8个，用生物蛋白胶粘合剂将PLGA膜片粘合在关节面端表面，环氧乙烷消毒塑料袋密封常温保存备用。
　　1.2.2 种子软骨细胞获取、扩增及软骨细胞-材料复合物的体外构建：采用林荔军[7]法获取种子软骨细胞，进行细胞培养。细胞贴满皿底后传代扩增。重复该过程至第三代细胞融合。将第三代软骨细胞消化、计数、台盼蓝染色检测扩增的关节软骨细胞活力95%以上，制成细胞浓度为5×107/ml的悬液备用。将经环氧乙烷消毒后的四组材料(见表1) 分别置入四个培养皿中,用少量培养液湿化，用上述细胞悬液各5ml均匀滴在每个材料上，6h后加入培养液，以后每2天换液一次,培养至1周。
　　
　　1.2.3 软骨细胞-支架材料复合物动物体内植入及观察：成年日本大耳白兔32只，随机分为A、B、C、D共4组，每组8只，分别植入相对应组别的软骨细胞-支架材料复合物。植入物种植于取左后足第2趾跖骨头位置。A、B、C组实验兔自跖骨头下5mm水平咬骨钳咬除跖骨关节头，造成缺损长度在0.8cm左右，将相对应的A、B、C组软骨细胞-支架材料复合物按原解剖位置植入关节缺损处，39号医用钢丝骨断端处环扎内固定，关节复位，修复肌腱，关闭切口，酒精纱布包裹。D组实验兔保留自体跖趾关节，跖骨关节头软骨全层用电钻毁损，形成孔洞模型，直径4mm,深度5mm,将软骨细胞-PLGA材料复合物置入孔洞内，关节复位，修复肌腱，关闭切口，酒精纱布包裹。术后四组实验兔均予青霉素80万单位肌注，1天2次，共3天。实验兔单只笼内放养，伤口均愈合良好，于3月后处死动物取材观察及检测。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 大体观察：A组表面未见明显新生软骨样结构。B组和C组关节腔内可见新生物出现，呈较典型的半透明类软骨样结构形成；关节腔内的新生物与冻干骨平台无紧密粘连（图1）。D组所有样本关节面表面均基本修复完整，原孔洞处出现白色新生物，新生物外观光滑，探针触感质地似软骨样，与周边组织无明显肉眼边界（图2）。
　　2.2 显微镜下观察：HE染色可见A、B组冻干异体骨关节面表面软骨组织吸收、裂解，局部破碎，软骨陷窝处未见软骨细胞存活，关节面处无新生软骨层。B、C组关节腔内获得的类软骨样结构镜下可见典型软骨光镜下结构特点，软骨陷窝内见活性细胞结构，细胞周边为均匀的软骨基质成分，软骨样结构边缘可见纤维结缔组织成分（图3）。D组镜下可见新生软骨样结构修复原自体关节面软骨层孔洞缺损，新生软骨样组织与原自体关节孔洞缺损边缘有较明显组织学外观差异，细胞形态较幼稚，但两者粘合紧密（图4）。II型胶原免疫组化染色均观察到B、C组及D组HE染色显微镜下观察到的软骨结构II型胶原棕褐色反应，为阳性染色结果，证实新生物中存在特异性软骨基质成分。
　　
　　3讨论
　　
　　支架材料是构建组织工程软骨的物质基础。软骨种子细胞的培养与扩增对微环境有特殊的要求。支架材料要能为种子细胞提供一个三维生长环境，使种子细胞在其中繁殖、生长、代谢，发挥细胞间的信号调控作用，不断分泌细胞外基质，以逐步取代降解的支架材料，最终形成有活性的软骨组织。
　　
　　关节软骨为透明软骨，组织学特点为软骨陷窝周边为大量软骨基质成分，形成较均匀紧密的结构，故即使经深低温冷冻干燥处理，冻干骨关节的关节软骨面组织仍然无法形成组织工程细胞培养所需的三维腔隙结构，总体孔隙率不足以提供细胞生长、增殖、物质交换所需的三维空间需求。故在单纯冻干骨表面种植软骨细胞进行动物体内实验，笔者认为形成新生组织工程化关节软骨难度大。PLGA[8-9]材料由PGA和PLA共聚而成，具有优良的生物相容性，无毒、可生物降解，可控性良好。本实验选用的PLGA降解周期为6～8周。已有很多学者报道应用PLGA支架材料在体外或实验动物体内再造形成各种组织工程化软骨[10]。前期试验中，笔者观察到冻干骨和聚羟基乙酸聚乳酸共聚物(PLGA)材料表面软骨细胞均有粘附增殖及基质分泌，但后者明显优于前者[11]。因此，笔者考虑在冻干骨支架上粘合PLGA材料使软骨细胞获得良好的生存环境，以利再造形成类关节软骨样结构。
　　A组没有产生新生软骨样组织。B组和C组关节腔内产生了经切片检查证实的类关节软骨样组织。D组植入自体关节孔洞缺损3月后，取材观察见所有样本缺损处均基本修复，新生组织具有软骨样外观及质地。显微镜下见较典型的单一的软骨组织。和A组相比较，这表明软骨细胞-PLGA膜片在类关节软骨样组织的形成过程中起了决定性的作用。笔者分析，在冻干骨关节面表面由于没有出现三维立体空间结构，无法满足软骨细胞的营养代谢和物质交换需求，故植入实验兔体内后软骨细胞无法长期存活，难以重建软骨层；与此相对应，PLGA膜片为种植的软骨细胞提供了需要的三维立体空间结构，故在体内产生了类关节软骨样组织。但是，笔者在显微镜下同时也观察到B、C组关节腔内出现的并不是典型的关节软骨层结构，其与纤维结缔组织共同出现，故笔者只是称之为类关节软骨样组织；况且，这种类关节软骨样组织与冻干骨表面没有产生紧密的组织学联系，所以它们可能不具备关节软骨层的组织学功能。
　　本实验中异体软骨细胞-PLGA支架材料复合物可修复D组的自体软骨缺损，但在冻干骨支架上未能形成笔者预期的有组织学功能的新生关节软骨层。A、B、C组植入术后形成的关节均为半自体、半异体所组成的复合关节，其营养供给必然受限；而D组的营养供给则要明显充裕，有利于细胞的功能发挥和软骨重建，故实验结果理想。笔者认为冻干骨的致密的组织形成的单层界面导致种植的软骨细胞无充足营养供给也是其可能原因。
　　对此，笔者设想对冻干骨材料进行一些改进或许能实现之前的实验目的。虽然关节头处软骨层结构致密，但软骨层下方即为具有三维多孔疏松网状结构的松质骨；之前笔者制备去关节软骨面冻干骨（C组）时在关节颈水平截骨，软骨层下方的松质骨也同时丢弃，骨断面为致密皮质骨，软骨细胞或细胞支架材料复合物粘附生长不佳。笔者制备冻干骨支架时仅将致密软骨层磨去而将软骨层下方的松质骨保存，或可脱钙处理去除骨内沉积的钙盐使支架材料结构更为疏松，脱钙骨基质中含有骨形态发生蛋白具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力。以此为细胞载体，可能这样的冻干骨支架有助于形成有功能意义的关节软骨层[12-13]。这些设想需留待今后的实验进一步验证。
　　
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　　[收稿日期]2007-06-18[修回日期]2007-09-25
　　编辑/张惠娟