局部用雷帕霉素聚乳酸乙醇酸共聚物缓释微球的制备及释药研究:聚乳酸微球

　　[摘要]目的:介绍雷帕霉素(RAPA)聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)缓释微球的制备方法,建立高效液相色谱法(HPLC)测定体系以检测微球中雷帕霉素含量,检测微球性状并进行体外释药实验。方法:以聚乳酸乙醇酸共聚物为载体,采用W/O/W 乳剂-扩散溶剂挥发法制备雷帕霉素缓释微球,扫描电镜检测微球外观及微球粒径,HPLC检测微球载药量、包封率及体外释药量。结果:所制微球光滑圆整,大小均一,平均粒径:(121.18±27.83)μm,载药率:(14.39 ± 1.32)%,包封率:(72.92±4.29)%,体外释放实验显示1～4天有突释,随后平稳释药至第10天累积释药率达80%。结论:采用制备工艺稳定,所制微球载药量及包封率均较高,形态完整,大小均一,体外释药较为平稳并且具有明显的缓释作用。
　　[关键词]雷帕霉素;缓释;微球;PLGA
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)03-0334-04
　　
　　Preparation and in vitro release study of rapamycin in poly(lactic-co-glycolic )acid microsphere for topical administration
　　PEI Jiao-miao,XUE Xiao-yan,LIU Bei,XIA Wei,LUO Xiao-xing,GUO Shu-zhong
　　(Institute of Plastic Surgery of People"s Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo optimize the preparation technology of poly (lactide - co - glycolide) (PLGA) microspheres loaded with rapamycin (RAPA-PLGA-MS), establish a HPLC method for content determination of rapamycin in microspheres and study powder particle characteristics and in vitro release characteristics of RAPA-PLGA-MS. Methods RAPA-PLGA-MS was prepared with PLGA as carriers by the water-in-oil-in-water(W/O/W) emulsion solvent evaporation method. Scanning electron miroscope (SEM) and HPLC were used to evaluate the micromeritic characteristics of RAPA-PLGA-MS, such as the particle size,loading efficiency, and entrapment efficiency and in vitro release characteristics.ResultsThe prepared microspheres were spherical with smooth surfaces,with an average particle size of (121.18±27.83) μm. The loading and encapsulation efficiency were (14.39±1.32)% and (72.92±4.29)% respectively. The in vitro release curve of RAPA-PLGA-MS was up to 80% in 10 days.Conclusions Rapamycin poly(lactic-co-glycolic )acid microspheres was successfully prepared and has obvious sustained release.
　　Key words:rapamycin;controlled release;microspheres;PLGA
　　
　　随着显微外科技术的进步与推广以及抗免疫排斥药物的研发与改良,同种异体复合组织移植在整形外科领域的应用也有了更为广阔的天地,但是限制其发展的瓶颈依就是免疫抑制剂全身长期应用所带来的毒副作用[1-2],因此需要寻找出一种毒副作用小的治疗方案。雷帕霉素是一种新型强效免疫抑制剂,本课题组已于2007年证实雷帕霉素(rapamycin,RAPA)局部应用可以明显延长大鼠异体皮瓣存活时间[3],但是由于雷帕霉素半衰期为57～62h[4],而急性排斥反应往往发生于术后一个月内,因此制备雷帕霉素聚乳酸乙醇酸共聚物(poly lactide-co-glycolide,PLGA)缓释微球应用于局部不仅可以降低全身的毒副作用,而且可以降低局部药物浓度的波动使局部长期保持有效的药物浓度,减少给药次数。PLGA是一种生物相容性好的可降解材料,目前已广泛用于缓释载体、组织工程支架材料及手术缝合线等领域[5]。本实验以PLGA为载体材料,采用复乳-溶剂挥发法制备雷帕霉素的PLGA缓释微球[6],检测其理化特性并进行体外释药实验。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料与设备:雷帕霉素(华北制药集团有限责任公司,纯度>95%);乳酸-羟基乙酸共聚物物n (LA) :n ( GA) = 75 ∶25 (PLGA, sigma公司,USA);聚乙烯醇、二氯乙烷(Alfa Aesar公司,Sweden);乙腈、甲醇(色谱级,SK Chemicals,Korea);二甲基亚砜(DMSO,ACS grade,Amresco公司);冷冻干燥机(FD5-3,SIM公司,USA);HH-42快速恒温数显水箱(常州国华电器有限公司);Mettler-Toledo电子天平(AL104,Sweden);超声波细胞粉碎机(SCIENTZ-ⅡD,宁波新芝生物科技股份有限公司);Waters高效液相色谱仪(alliance, 2695/2996,USA); MQS-50F01纯水机(Millipore公司,USA);色谱柱Venμsil XBP-C18(5μm,4.6mm×250mm);RW.20N.n IKA机械式搅拌机(上海棱普仪器仪表有限公司);扫描电子显微镜(日立S-3400N,Japan);TGL-16B、TDL-5 型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
　　1.2 雷帕霉素微球制备:根据预实验中优化后的处方,采用W/O/W乳剂-扩散溶剂挥发法制备雷帕霉素缓释微球(Rapa-PLGA-MS)。称取PLGA 600mg 加入到4ml二氯甲烷中,完全溶解后作为油相,取300μl 10mg/ml 雷帕霉素溶液加入油相,室温混匀。另取1ml 2% 聚乙烯醇溶液作为内水相,加入至油相。将上述混合溶液迅速冰浴超声90s,形成W/O乳白色初乳。然后将初乳缓慢滴加入1%聚乙烯醇外水相溶液中, 用高速分散均质机快速搅拌60s即得W/O/W复乳。室温下用机械式搅拌机以1000r・min-1持续搅拌4h,直至有机相逐渐挥发完全微球固化,冷无菌三蒸水洗涤离心5次,分离微球,冷冻干燥48h,即得Rapa-PL GA-MS。
　　1.3 微球形态观察及粒径检测:取Rapa-PL GA-MS样品3份均匀涂布于盖玻片,真空干燥,喷涂金粉,扫描电镜观察Rapa-PLGA-MS的形态。选取Rapa-PL GA-MS 6个样本,每个样本含微球不少于250个,同样方法进行扫描电镜检测其粒径大小,计算微球的平均粒径。
　　1.4 雷帕霉素含量测定
　　1.4.1 色谱条件:流动相:乙腈/水(75/25);等度洗脱;紫外检测波长278 nm;流速1 ml/min;柱温40℃;样品温度25℃;进样量:20μl[6]。
　　1.4.2 标准曲线的绘制:精密称取雷帕霉素对照品24mg, 置于10 ml 容量瓶中,用乙腈溶解并定容,得到2400μg/ml 雷帕霉素对照品储备液。将雷帕霉素对照品储备液用乙腈逐级稀释,分别得到24、12、6、3、1.5、0.75μg/ml 对照品标准曲线系列溶液,进样并记录色谱图,以峰面积(AU)对溶液质量浓度(ρ,μg/ml )作线性回归,得到回归方程。
　　1.5 精密度和回收率实验:分别配制质量浓度20μg/ml、5 μg/ml、1μg/ml的雷帕霉素对照品溶液,采用上述色谱条件,进样分析。分别在1天内重复测定5次计算日内精密度(intra-RSD),连续测定3天计算精密度日间(inter-RSD)。将测得的峰面积代入标准曲线计算雷帕霉素含量,将计算所得值除以已知含量即得到方法回收率。
　　1.6 包封率与载药率的测定:取样品7.7mg,加入1ml乙腈,将此溶液超声震荡5min,涡旋混匀30min,静置后取上清进样,按照1.4.1所述色谱条件进行检测,记录峰面积代入线性回归方程计算雷帕霉素的含量,并按照下式计算载药量和包封率。
　　载药率=样品测定浓度×样品体积/取样质量×100%
　　包封率=样品测定浓度×样品体积/样品中雷帕霉素含量的理论值×100%
　　1.7 雷帕霉素微球体外释药的研究:本试验以pH 7.4 磷酸盐缓冲液为溶出介质。精密称取Rap-PLGA-MS15 mg,用2 ml pH 7.4磷酸盐缓冲液(含0.3%吐温80)溶解。(37±1) ℃,100r・min-1 恒速搅拌,每天取样1次连续取样20天,每次取样200μl,同时补加等温、同体积的释药介质; 用HPLC法测定样品浓度,每个样品重复测定3次,按标准曲线方程计算累积释药率(Q,%)。
　　
　　2结果
　　2.1 微球外观及粒径:所制微球形态圆整,表面光滑无破损,大小均匀。平均粒径为:(121.18±27.83)μm。
　　2.2 微球中雷帕霉素含量测定方法的建立及标准曲线的绘制:按照上述方法在该色谱条件下,雷帕霉素与其他物质分离良好,理论塔板数大于60 000,最低检测限为37.5 ng/ml。以峰面积(A)对溶液质量浓度(ρ,μg/ml)作线性回归,得到回归方程:A=5.9614ρ+0.8166, r=0.9999,结果见图2。表明雷帕霉素浓度在0.75～24μg/ml之间线性关系良好。
　　2.3 精密度与回收率:按照上述方法测得日内、日间精密度均符合要求,回收率均在95%～105%内(结果见表1、2、3)。结果显示所采用的测量方法日内及日间误差小,在可控范围之内,以此方法进行微球中雷帕霉素含量检测数据准确可靠。
　　2.4 包封率与载药率:将3批不同时间点制备的微球取样,按照上述方法测得微球的平均包封率为:(72.92±4.29)%,载药率为:(14.39±1.32)%,结果显示所制备微球载药率及包封率较高。
　　2.5 载药微球体外释药结果:体外释药实验表明微球在前4天会有突释效应,这与微球表面药物释放有关,随后进入缓释阶段,第10天其累计释药率达到80%,直至22天累计释药率达到95%,22天至25天的突释与微球自身崩解有关。
　　
　　3讨论
　　同种异体复合组织移植的广泛应用为整形美容外科移植领域的发展提供了更为广阔的空间,很大程度上解决了以往拆东墙补西强的弊端[7],虽然手术技术方面已较为成熟,但是抗免疫排斥药物的大剂量全身应用所带来的毒副作用却常常让整形外科医师望而却步[8],如何在保证不发生急性排斥反应的同时又尽可能降低抗免疫排斥药物的毒副作用是当今探讨的热点话题之一。雷帕霉素是一种强效免疫抑制剂,1999年被FDA批准上市,临床上多以雷帕霉素配合环孢素或他克莫司(FK506)等进行移植后的免疫抑制治疗[9],并且证实对急慢性排斥反应均有良好的防治效果,但是雷帕霉素及其联合治疗所用药物的长期全身用药会导致许多毒副作用,如:肝肾毒性、高脂血症、高胆固醇血症、骨髓抑制等不良反应[4,10],这些问题对于处于免疫抑制状态的患者来说都不容忽视,有的甚至是致命的,所以建立局部给药方法就显得颇有意义了。有实验证明雷帕霉素局部用药加全身小剂量用药在同种异体复合组织移植动物模型中可以明显延长皮瓣存活时间[3],但是雷帕霉素半衰期约60h而急性排斥反应可能发生在术后一个月内,局部雷帕霉素PLGA缓释微球给药系统的建立可以使局部达到长期有效并且平稳的药物浓度,在减少全身用药量及其毒副作用的同时也减少了用药剂量及给药次数,减轻了患者的痛苦及经济负担。
　　PLGA是一种可生物降解的高分子聚合物,组织相容性好,已被广泛应用于药物的缓控释载体,手术缝合线、组织工程、骨科内固定等材料。本实验通过W/O/W乳剂- 扩散溶剂挥发法制备雷帕霉素PLGA微球,通过预实验发现转速,乳化时间,投药比例等对微球大小有重要影响,本实验发现该制备条件是较为理想的,方法简单,结果可靠。所得微球表面光滑圆整,形态规则,大小均一,包封率及载药率较高,体外释药实验证实其具有明显的缓释效果,于10天累积释药率达到80%,达到预期的缓释目标,释药实验中土温-80的加入明显加速微球的释药速度,我们还将进一步在大鼠体内进行药物代谢动力学实验,验证其体内的代谢速率。
　　本课题的创新点在于雷帕霉素缓释微球的成功制备给我们提供了新的给药方法,通过文献查阅发现目前尚无人在此方面做过相关工作,我们可以在手术过程中我们可以在游离皮瓣缝合前于受者创面处均匀涂布一定剂量的雷帕霉素缓释微球,术后可以全身给于小于常规剂量的环孢素或FK506,以期有效地减少全身给药剂量,待皮瓣建立自身血液循环而不再依赖吻合血管供养后,利用吻合血管进行灌注给药,这样以来为局部长期用药提供了可能性,并且使得全身小剂量用药变得更加安全,本课题组还将以此微球为基础,进行大鼠体内药物释放实验,并且利用大鼠下腹部游离皮瓣模型进一步验证雷帕霉素缓释微球局部给药系统的有效性和可行性。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2009-11-16 [修回日期]2010-02-23
　　编辑/张惠娟