明胶微球的制备【ＶＥＧＦ明胶缓释微球对大鼠背部随意皮瓣存活的影响】

　　[摘要]目的：研究局部注射血管内皮生长因子(VEGF)复合明胶微球对SD大鼠背部随意皮瓣存活的影响。方法: 采用改良的乳化冷凝法交联制备复合VEGF 的明胶缓释微球,将其注射于大鼠背部随意皮瓣，24只SD大鼠随机分为复合VEGF微球组（A组）、VEGF治疗组（B组）和对照组（C组），术后7天分别进行皮瓣存活率、新生血管计数的检测。结果：术后7天皮瓣的存活率分别为(68.54±2.79)%,(58.65±3.26)%,（45.43±2.71）%,治疗组存活率显著高于对照组（P＜0.05），且存活质量A组最好；皮瓣内新生血管计数分别为(31.16±4.38),(25.41±4.06),(18.68±5.44)具有显著差异性。结论:VEGF缓释微球可以促进缺血皮瓣的血管新生,提升皮瓣存活率。
　　[关键词]血管内皮生长因子；微球；明胶；缓释；随意皮瓣；存活
　　[中图分类号]R622[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-04
　　
　　The efect of VEGF-impregnated microsphere system on random dorsal skin flap survival in rat
　　WANG Lu,GUO Shu-zhong,MA Xian-jie,SONG Bao-qiang,WU Shang-min,YI Cheng-gang
　　(Institute of Plastic Surgery of People"s Liberation Army, Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xian 710032)
　　
　　Abstract: ObjectiveTo study the effect of VEGF sustained release microsphere system on survival of the ischemic skin flap in rats．MethodsThe VEGF - impregnated microsphere was prepared by emulsified cold -condensation method and twenty-four SD rats were randomized into three groups with 8 rats each. An ischemic skin flap s of 8 cm ×2 cm were designed on the back. Rats received subdermal injection of the VEGF - impregnated microsphere ( group A) , VEGF (group B) and saline(group C). The survival rate of the flap and the number of the new bloods vessels were determined on the 7th day after operation. ResultsThe flap survival rate were(68.54±2.79)%, (58.65±3.26) %, (45.43±2.71)%respectively,with significant between any 2 group( all P＜0.05) and the survival quality of the group A was the best. And the number of the new blood vessels were(31.16±4.38),(25.41±4.06),(18.68±5.44)respectively.there was significant difference statistically.CondusionThe VEGF - impregnated microsphere can increases the neovascularization in ischemic skin flaps and augments their survival rate.
　　Key words: vascular endothelial grouth factors(VEGF);microsphere,gelatin;sustained-release;random pattern flap;survial
　　
　　应用皮瓣进行创面修复、功能重建及外形改善是整形外科最常用的治疗方法之一,但临床应用时往往有严格的长宽比例限制,超过一定长宽的比例皮瓣远端常发生缺血坏死。近年来有学者将血管内皮生长因子(VFGF)用于提高皮瓣成活率及其血管新生的报道,但由于VFGF在体内易被蛋白酶分解、半衰期短，局部一次使用生物学效应不能充分发挥，而采用微球系统控制生长因子局部释放是解决上述问题的一种有效方法。本实验通过改良的乳化冷凝法交联制备VFGF明胶缓释微球并检测其生物学性能，观察其促进大鼠背部随意皮瓣存活作用。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 材料与设备：VFGF：购自深圳晶美生物工程有限公司。明胶(等电点50,相对分子量99 000, Sigma)、美国Bio-RAD Model 550酶标分析仪、日本H600-1V型透射电镜、美国FJ一2003型计数仪。自制VEGF-明胶微球。人VEGF定量ELLISA试剂盒(QuantiKineR,R&Dsystems), 250 g/L戊二醛,丙酮,异丙醇,无水乙醚,液体石蜡,氨基乙酸为国产分析纯, Span-80( Sigma公司)为进口分析纯,水为双蒸水, JJ21型精确电子搅拌器仪,TGL216G高速离心机,GENESIS冻干机(Virtis公司),BX241 数码显微镜(Olympus)。健康SD大鼠24只，体重0.20～0.25kg，雌雄不限，随机分成A、B和C组，每组各8只。
　　1.2 VFGF明胶微球制备及性质测定
　　1.2.1 VFGF明胶微球制备：将含有10g/L Span-80的液体石蜡30ml置于三口瓶中预热至55℃,快速搅拌下滴加入同样温度的明胶水溶液4ml,并调节搅拌速度至450r/min,继续搅拌10min；形成油包水乳剂后迅速改冰浴,搅拌10min,使其完成固化；加入250g/L戊二醛0.1ml,搅拌下预固化2h,而后4℃固化24h,用丙酮、异丙醇、乙醚洗涤,挥去乙醚,真空干燥,得到粉末状淡黄色微球。用双蒸水洗净有机溶剂并冻干。将200μl的VFGF溶液滴加在20mg的冻干明胶微球上,在4℃保持24h以使VFGF完全融入微球。C060照射灭菌封存。 将生理盐水浸泡过的明胶微球涂片置于光镜下,观察其外形及分散度,同时测量膨胀系数.电镜下测量500个微球的直径计算其平均粒径。以算术平均径为微球的平均粒径,计算公式为：平均粒径=n1d1+n2d2+…+nndn/n1+n2+n3 +…+nn,式中n1,n2…nn为粒子数,d1,d2…dn为粒径。
　　1.2.2 VFGF明胶微球体外释放测定：根据人VEGF ELISA试剂盒说明用酶联免疫仪于490nm测定吸光度值(A值)绘制标准曲线。取微球样品10mg,放入PBS(pH7.4)缓冲液中,完全溶解后定容至100ml,取10μl另加90μl共100μl测出A值。由此计算出微球的载药率和包封率.载药率=(投药量-上清液中药量)/微球重量×100%；包封率=(投药量-上清液中药量)/投药量×100%。
　　动态透析法进行体外释药实验,将制备的复合缓释微球10mg混悬于PBS(pH7.4)100ml中,置于37℃水浴摇床(135r/min)分别于各时间点(1,2,3,4,5,6,7天)取上清液100μl,测量其浓度,绘制复合微球释药曲线。
　　1.3 大鼠背部缺血皮瓣模型的制备：戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，将动物俯卧位固定，鼠背部以10%硫化钠脱毛，温水洗净。于鼠背正中掀起8.0cm×2.0cm随意皮瓣,其纵轴与大鼠脊柱平行，且以之为对称轴，蒂位于双侧髂嵴连线上。在距离蒂部3.6cm、4.8cm、6.0cm处分别作为蒂部平行的直线，与顺皮瓣长轴的三等分线相交于六点，这六点为注射位点。切开皮肤及皮下，于筋膜浅层掀起皮瓣，结扎基底部活跃出血点。皮瓣掀起后即刻以微量注射器于皮下进针，A组皮瓣下每一注射位点给予200ng/ml VEGF-缓释微球1m1,B组皮瓣下每一注射位点给予200ng/ml VEGF溶液1m1，C组皮瓣下予等量的生理盐水注射1ml。3-0丝线将皮瓣原位缝合，切口涂红霉素软膏。单笼喂养。所有伤口隔日换药。肌注青霉素10万单位，2次/天。
　　1.4 观察指标：在术后14天内对皮瓣进行观察，观察指标有：
　　1.4.1 皮瓣存活率的检测：在皮瓣术后7天，皮瓣存活区与坏死区已明确。皮瓣坏死标准：皮瓣颜色发黑，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血。用数码相机进行皮瓣摄影，以Image-Pro Plus.v5.0软件分析皮瓣坏死区域，利用公式(皮瓣存活率=皮瓣存活表面积/皮瓣总表面积×100)，计算各组皮瓣存活率。
　　1.4.2 组织学检测：于皮瓣术后7天取皮瓣标本，OCT包埋剂包埋，液氮中保存，冰冻切片切成5μm厚度，进行行HE染色。切片在200倍光镜下随机选取8个高倍视野计数血管断面数目，血管断面密度。
　　1.5 统计学处理：数据均采用x±s表示，用SPSS 1 1.0统计软件包对数据进行方差分析，而两两间的比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 VEGF-明胶微球的表观,膨胀系数及平均粒径：光镜下及扫描电镜观察见制备的复合VEGF缓释微球干粉球体分散度良好,呈圆球体, 径粒较均匀。微球在生理盐水中的膨胀系数为1.3(直径),呈球型,无粘连,无塌陷或萎缩现象。干燥状态的微球表面有少量颗粒状吸附物,但未见微孔和裂纹, 如图1。在扫描电镜下测得微球粒径呈正态分布,大部分为10～28μm,占86.7% ,平均粒径为(11.32±3.64)μm。冻干粉剂为淡黄色疏松粉末。加双蒸水后为淡黄色乳状溶液。再分散性良好。如图2。
　　2.2 缓释微球体外释放度：根据测定的A值,计算出微球的平均载药率为0.26%,包封率为90.6%,载药微球的释药速度主要取决于药物的扩散速度和载体材料的降解速度,明胶微球在pH＞7.0时完全降解约需2月。复合微球具有良好的缓释性能,如图3所示，微球在释药初期速度较快,而后速度减缓平稳释放, 7天后累计释放93%。
　　
　　2.3 皮瓣观察结果
　　2.3.1 3组大鼠背部皮瓣存活率分别为：A组为(68.54± 2.79)％，B组为(58.65±3.26)％，C组为(45.43±2.71)％。经统计学分析，A组与C组、B组与C组之间比较，差异显著。A组的存活皮瓣较B、C组的颜色、质地、弹性更好,与其周正常皮肤更相似，质量更好如图（4～6）。皮瓣存活面积见表1。
　　
　　2.3.2 皮瓣的组织学检测：3组大鼠的皮瓣进行HE染色(如图7，8，9)，皮瓣术后7天的3组皮瓣单位面积平均毛细血管计数见表2：
　　
　　3讨论
　　
　　血管内皮细胞生长因子（VEGF）又称血管通透因子或促血管因子，是一种糖蛋白，能特异性地作用于其位于血管内皮细胞表面的受体，具有促血管内皮细胞增殖和迁移、促血管生成、延长血管内皮细胞寿命、提高血管通透性等生物学作用。它的受体主要为VEGFR-1(Flt-1）和VEGFR-2（KDR）。其中KDR 与血管形成和造血有关，Flt-1 在内皮细胞排列形成管腔时发挥主要作用[1]。Stepnick等[2]首次将VEGF应用于兔耳皮瓣模型,观察到皮瓣生存力提高。此后众多学者发现采用VEGF诱导治疗性血管形成，可以提高皮瓣成活率。Khan等[3]用大鼠背部随意皮瓣模型研究了VEGF(165)促进皮瓣存活的机制，结果认为其机制可能是：①VEGF使皮瓣在术后早期血流增加；②促进了血管新生使血流增加。同时实验认为，VEGF可以促进NO浓度的增加；VEGF促进皮瓣存活存在剂量依赖性，其作用可以被NO合酶抑制剂阻断。
　　
　　虽然VEGF的促血管生成作用得到了学者的普遍认同但由于VEGF生物稳定性差,生物膜透过性差, 局部作用半衰期短,直接应用效果不佳。采用VEGF 基因转染，只要少量目的基因转染成功，一次给药就可获得持续表达，无需重复多次给药，作用时间长，效果确切，是目前研究的热点。但Poliakova应用携带不同浓度VEGF121的腺病毒载体(Ad．VEGF121)转染兔、大鼠的后肢的肌肉时发现，Ad．VEGF121治疗剂量可导致暂时性中等的兔阴囊水肿，超过治疗剂量的浓度会引起伴有皮肤溃疡和坏死的广泛严重的兔阴囊水肿。由于基因载体的选择、转染效率的控制、转染成功后外源基因对宿主基因组的影响、基因表达的效率、表达产物的生物学效应、基因局部转染对远隔器官病理性血管增生的影响及促肿瘤生长等问题还需深入研究，因此其应用于临床还有一段距离。而缓释微球载体作为新型药物缓释控释系统之一,具有缓释药物、靶向输送、在保证药物治疗作用的前提下减少给药剂量,降低药物毒性等优点[4]是目前较为简便、安全的解决办法之一。明胶是氨基酸与肽类交联形成的直链聚合物,能进行多种表面修饰及反应,制备时可根据不同要求设计。而且明胶中含有RGD生物活性短肽有利于细胞表面粘附分子识别。明胶微球为实体微粒,被包裹药物释放相对缓慢,足以达到缓释的要求[5]Kawai等采用人工皮覆盖豚鼠背部的皮肤缺损创面，并在其间涂抹载有bFGF的明胶微球，组织学检测发现成纤维细胞增殖和新生毛细血管数均多于单纯使用bFGF组，他们认为单纯bFGF体内半衰期短，而明胶微球较好地保护了bFGF的活性[6]。
　　本实验采用改良的乳化冷凝法制备明胶微球,其机制是等电点为5.0 的酸性明胶在水中溶解后,分子伸展为纤维状,在冷冻脱水的条件下卷曲,并由多个分子凝聚成球状微粒,在固化剂(戊二醛) 的作用下,明胶分子呈稳定性良好的三维网状结构[7]。VEGF被明胶吸附并包裹于微球中,随着明胶的降解,实现VEGF在体内的控制释放。而且在冻干过程中，明胶还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，从而保护因子活性。将VEGF的明胶缓释微球应用于大鼠背部皮瓣模型可以显著促进皮瓣的存活率，明胶微球的应用促进了VEGF的促血管新生作用，使用VEGF明胶微球后皮瓣中部的血流量明显高于单纯使用VEGF和盐水对照组，在术后7天效果最为显著，与缓释微球的生物学特性符合一致。组织学检测也同样验证了上述论断，使用了缓释微球的皮瓣其血管数目显著增加，管腔增粗，皮瓣存活质量也比对照组质地柔软，弹性较好。而且皮瓣中部的血流量也得到了明显提高，VEGF微球的治疗效果优于单纯使用VEGF。
　　本实验显示缓释微球能显著延长VEGF的作用效果，能显著增加皮瓣与受区的血管新生，增加皮瓣的血流量，从而促进皮瓣的存活率及生存质量，但如何提高微球的载药率、延长微球的缓释作用还需进一步研究，为其早日应用于临床奠定坚实的基础。
　　
　　[参考文献]
　　[1]LinP,Sankar S，et al.Inhibition of tumor growth by targeting tumer endothelium using a soluble vascular endothelial growth factor receptor.Cell Growth Differ 1998,9(1):49-58.
　　[2]Stepnick DW, PetersonMK, Bodgan C, et al. Effects of tumor necrosis factor alpha and vascular permeability factor on neovascularisation of the rabbit ear flap [J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1995；121(6):667.
　　[3]Khan A，Ashrafpour H，Huang N，et a1．Acute local subcutaneous VEGF165 injection for augmentation of skin flap viability：efficacy and mechanism[J]．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，287(5)：R1219.
　　[4]Nimni ME. Polypeptide growth factors:targeted delivery systems[J].Bio Materials,1997,18:1201-1225.
　　[5]隋继强,韩 岩,吴 红，等. 人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子纳米缓释剂对成纤维细胞的影响[J]. 中国美容医学,2006,15(12):1342-1345.
　　[6]Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，et a1．Accelerated tissue Regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factor-impregnated gelatin microspheres into artificial dennis[J].Biomaterials，2000,21(5)：489-499．
　　[7]Rita C, Elisabetta E, Maria O. Dextran cross-linked gelatin micro2 spheres as a drug delivery system[J]. European J Pharm and Biopharm,1999,47 :153.
　　
　　[收稿日期]2007-12-17[修回日期]2008-03-11
　　编辑/张惠娟