机械应力刺激对培养的人成纤维细胞分泌生长因子的影响_重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶

　　[摘要]目的：研究单次持续40％幅度的牵拉作用于人皮肤成纤维细胞后bFGF、TGFβ1的表达，初步探讨机械应力作用下细胞增殖的机理。方法：体外培养人正常皮肤成纤维细胞，将细胞转移至牵拉细胞培养模型中的弹性膜上，待细胞贴壁生长至75％～80％融合时，实施40％单次持续牵拉，用WESTERN-BLOT对非牵拉组与牵拉组24h、36h、48h、72h的细胞bFGF、TGFβ1进行检测。结果：牵拉各组及对照组均呈阳性表达，但牵拉48h后两者的表达较未牵拉时明显增加。结论：单次40％持续的牵拉方式可以促进bFGF、TGFβ1表达，可能是导致细胞的增殖。
　　[关键词］成纤维细胞；机械牵拉；碱性成纤维细胞生长因子；转化生长因子β1
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-03
　　
　　The effect of mechanical stress on the expression of growth factor in human skin fibroblast
　　SHU Mao-guo,YI Cheng-gang,HAN Yan,YANG Li,ZHANG Lin-xi,XIA Wen-sen,LIU Dan,GUO Shu-zhong
　　(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi, China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo study the expression of bFGF,TGFβ1 of human skin fibroblasts treated by mechanical stress.MethodsA new cell culture model was designed, which can load mechanical strain. Primary cultured skin fibroblasts were obtained from full thickness skin residual in skin-graft surgery. The fibroblasts were planted on elastic membranes of the model. After the 75%～80% confluence of the cell was reached, mechanical stretch was applied. The extend degree was 40% in the experiment and after stretching for 24h,36h,48h,72h, and cells were counted to quantify the protein and the expression of the bFGF, the TGFβ1 was detected with western-blot.ResultsThe expression of bFGF and TGFβ1 was positive in all groups,but the expression of growth factors was much more enhanced after stretching for 48h.ConclusionMechanical stretch with 40% extend degree and one time but continues load can increase the expression of bFGF and TGFβ1.The peak time is 48h after stretching.
　　Key words: mechanical stress; skin fibroblasts; bFGF；TGFβ1
　　
　　机械应力刺激培养中的细胞分泌生长因子的相关文献报道较多，但多限于其他类型的细胞，且均以测定mRNA的研究为主，作用方式亦多为周期负压方式。单次足够幅度的刺激是否亦能促进生长因子的分泌，分泌时间上有什么特点，既往的文献则鲜见报道。本实验直接检测40%牵拉延长度的应力作用下bFGF、TGFβ1在牵拉后不同时间点的表达情况，以了解单次较大幅度的应力刺激对培养的皮肤成纤维细胞分泌bFGF、TGFβ1的影响。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1仪器与试剂：净化工作台，倒置相差显微镜，CO2孵箱，细胞牵拉培养模型（自制），DMEM培养基（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（杭州四季青公司），Tween-20（Sigma），垂直平板电泳仪（美国Bio-Rad公司），硝酸纤维素膜（NC膜）（Clontech），鼠抗人bFGF一抗（武汉博士德），鼠抗人TGFβ1一抗（武汉博士德），羊抗鼠二抗（Sigma），ECL发光系统（Amersham公司）
　　1.2.1 机械牵拉细胞培养模型的制备（见图1、2）：牵拉细胞培养模型采用直接机械牵拉作用的原理，将细胞直接种植在硅胶弹性膜上，待细胞帖壁生长后，牵拉弹性膜，而此时贴壁的细胞亦随着弹性膜的单向拉长而拉长，同时改变细胞与细胞之间的距离。自制的牵拉细胞培养模型采用有机玻璃以及经特殊加工的硅胶膜为主要材料[1]，C060照射（11kGy）备用，牵拉延长度设置为40％。
　　1.2.2 细胞培养及牵拉的实施：实验所用皮肤成纤维细胞来源于健康人体皮肤，常规行原代培养，传代，实验用3～5代的细胞。0.25%胰酶消化玻璃培养瓶中的正常皮肤成纤维细胞，含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，反复吹打制成细胞悬液，以0.5×104～1×104个/�2传至细胞培养盒中，24h后第一次换液，以后每隔48h换液，待细胞长至75%～80%满时，更换培养液，旋动培养盒外的螺母，拉动盒内的螺杆，牵引固定板上的弹性膜，根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长40% ，继续置二氧化碳孵箱中培养。实验分为对照组（未牵拉组）与牵拉24h、36h、48h、72h共5组。
　　
　　1.2.3 bFGF及TGFβ1的检测：收集牵拉与非牵拉组细胞各1×106个，蛋白裂解液裂解提取蛋白，行蛋白电泳，用WESTERN-BLOT法测定蛋白含量，将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜（NC）上，加一抗（稀释倍数为1：200），将膜装入塑料袋中，加入PBST稀释好的二抗液，用滤纸将膜上液体吸干，在ECL反应物中反应，压X-线片，定影、显影。
　　1.2.4 蛋白条带采用Smartview 2001的采集、分析。
　　
　　2结果
　　
　　2.1牵拉不同时间点bFGF的表达：结果显示对照组与实验组牵拉各时间点（24h、36h、48h、72h）在分子量为18KD处均可见有阳性表达，通过对各蛋白条带行图像分析可看出，随着牵拉时间点的后移，蛋白条带的密度呈逐渐升高的趋势，到牵拉48h时密度值达到最高，之后下降（图3）。
　　
　　2.2 生物电泳图像分析系统采集密度值（表1）：
　　
　　2.3 牵拉不同时间点TGFβ1的表达：结果显示对照组与实验组牵拉各时间点（24h、36h、48h、72h）在分子量为25KD处均可见有TGFβ1的表达，通过对各蛋白条带行图像分析可看出，随着牵拉时间点的后移，蛋白条带的密度呈逐渐升高的趋势，当牵拉48h时密度值达到最高，之后便下降（图4,表2）。
　　
　　
　　3讨论
　　
　　机械应力作用培养中的细胞通过自分泌或旁分泌的方式分泌生长因子，而生长因子再反作用以调节细胞的增殖、分化的理论已被广大学者所肯定。由于生长因子与细胞增殖分化的关系，在机械应力作用培养的细胞并导致细胞增殖的研究领域中，生长因子与机械应力的关系一直是研究的热点。
　　碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是含有155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，分子量为16～18.5KD，具有广泛的生物功能，是中胚层和神经外胚层细胞的生长刺激剂，是重要的促细胞有丝分裂因子，是一种广谱的有丝分裂原，是形态发生和分化的诱导因子，对成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞以及血管内皮细胞具有很强的促细胞分裂增殖的活性[2]，在体外培养中低浓度（1mg/ml）即能发挥作用。
　　机械应力作用培养中的细胞导致细胞分泌bFGF的相关研究报道不多，Cheng [3]利用周期性应力作用方式（14%延长度，1Hz）作用培养的人血管平滑肌细胞，同时比较了不同的作用次数对细胞bFGF的含量的影响，结果显示：1次、9次、90次应力作用后总细胞bFGF的含量分别为(0.55±0.06)%，（2.9±0.3）%，（5.5±1.3）%，说明随着作用次数增多，细胞bFGF的含量亦增多，但是，当次数超过90次甚至达到90000次时，bFGF的含量并不再增多；作者认为，机械应力作用培养的细胞并刺激细胞分泌bFGF不仅依赖于应力所造成的频率，而且依赖应力所造成的牵拉幅度（延长度），同时作者采用4%的牵拉幅度（90次，1Hz）的应力刺激，只获得（0.1±0.1）%的总bFGF量，但是当牵拉幅度达33%时，获得（19.0±3.0）%的bFGF量，因而，机械应力可控制血管平滑肌细胞释放细胞内bFGF，但小幅度的牵拉对细胞的影响则是微不足道的。
　　TGFβ是由多基因家族编码的一类多效能因子，其活性结构是由质量分子为12500的亚单位肽链通过二硫键连接而成的同源二聚体（分子量为25KD），几乎存在于所有的细胞中。TGFβ是一种具有多种生物学效应的生长因子，可以调节细胞增殖、刺激细胞外基质的合成、诱导血管形成，参与胚胎发育等。对上皮细胞表现为抑制作用而对皮肤成纤维细胞则表现为促进增殖，与组织损伤与修复密切相关[4]。
　　Li-Q[5]等报道利用10%的延长度、30次/min的周期性应力作用血管平滑肌细胞，24h后，胶原合成增加2倍，同时在培养基中发现TGFβ1（活性以及非活性的状态）分泌增加，利用抗TGFβ1中和抗体能抑制牵拉导致的胶原及总蛋白合成。Takashi[6]等利用周期性应力（0.5Hz，9%～12%的延长度）对鼠肾小球系膜细胞进行作用48h后证实：TGFβ1mRNA的水平在作用后12h内一直保持不变，增加的最高峰出现在牵拉后48h，同时牵拉培养基中的TGFβ1的生物活性在12h以前较未牵拉组并未发现明显差异。Maruyama T[7]等采用间断的应力加载方式作用犬的肾小管上皮细胞，作用24h即可见TGF-beta1浓度增加。
　　本研究根据以上理论，结合临床上扩张术、牵张术的应力作用特点，将应力作用幅度设置到40%，同时将应力作用次数改为1次（但是并不放松而继续保持张力），研究牵拉过程中bFGF、TGFβ1的表达。结果显示，应力作用后所有的细胞均出现蛋白的表达，但是对比发现：牵拉36h组与对照组的表达存在着明显差异，牵拉48h组表达达到最高峰。结果证实单次足够幅度的机械牵拉（延长度为40％）能刺激细胞分泌bFGF、TGFβ1。显然，在扩张术、牵张术目前所采用的应力作用方式能促进人皮肤成纤维细胞增殖，同时，细胞的自分泌或旁分泌作用分泌的bFGF、TGFβ1起着相应的作用，它成功地诱导了成纤维细胞的增殖，促进了细胞外基质的分泌，这与临床上所观察到的结果是相一致的。
　　机械应力作用培养中的细胞并促使其增殖的原理非常复杂，根据Cindy[8]的总结：应力作用细胞，细胞通过其膜上的整合素、G蛋白、离子通道等感受到细胞所受的应力，通过改变其空间构向，促使离子的交换，电位的变化等，产生下一步复杂的信号转导过程：一方面，直接牵拉与整合素相连的细胞内的细胞骨架，直接作用细胞核；另一方面则通过一系列的信号分子的聚集、活化等，产生级联反应（机械应力作用细胞最肯定的信号途径包括两组：MAPK途径，JAK/STAT，最后作用于胞核。在这一系列的反应过程中，生长因子的自分泌或旁分泌作用在细胞的增殖反应过程中起着非常重要的作用。
　　机械应力促使细胞增殖的原理到底是什么，是机械应力直接启动了细胞的增殖信号？还是应力改变了细胞与细胞之间的距离，解除了接触抑制？还是应力刺激过程中拉动了细胞与细胞之间特殊的结构连接，导致细胞上特殊的物质激活从而导致一系列信号的传递呢？现有的理论，多考虑为诸多因素共同作用的结果。但为什么不同的应力作用方式、不同的细胞以及不同的机械牵拉幅度会造成不同的刺激效应？机械应力对细胞的应力作用哪些是共性的，哪些是个性的？目前的研究结果远未能解释以上疑问。
　　
　　[参考文献]
　　[1]舒茂国,郭树忠,张琳西,等. 培养细胞牵拉模型的建立与牵拉后细胞生长曲线的相关研究[J].中国美容医学，2002,11(1)：14-16.
　　[2]Coltrini D, Rusnati M, Zoppetti G, et al. Biochemical bases of the interaction of human basic fibroblast growth factor with glycosaminoglycans. New insights from trypsin digestion studies[J].Eur J Biochem, 1993,214(1):51-58.
　　[3]Cheng GC, Briggs WH, Gerson DS, et al. Mechanical strain tightly controls fibroblast growth factor-2 release from cultured human vascular smooth muscle cells[J].Circ Res, 1997,80(1):28-36.
　　[4]Kletsas D, Basdra EK, Papavassiliou AG. Mechanical stress induces DNA synthesis in PDL fibroblasts by a mechanism unrelated to autocrine growth factor action[J].FEBS Lett, 1998,430(3):358-362.
　　[5]LinksLi Q, Muragaki Y, Hatamura I, et al.Stretch-induced collagen synthesis in cultured smooth muscle cells from rabbit aortic media and a possible involvement of angiotensin II and transforming growth factor-beta[J].J Vasc Res,1998,35(2):93-103.
　　[6]LinksYasuda T, Kondo S, Homma T, et al. Regulation of extracellular matrix by mechanical stress in rat glomerular mesangial cells[J].J Clin Invest,1996,98(9):1991-2000.
　　[7]Maruyama T, Hayashi Y, Nakane A, et al. Intermittent pressure-loading increases transforming growth factor-beta-1 secretion from renal tubular epithelial cells: in vitro vesicoureteral reflux model[J]. Urol Int, 2005;75(2):150-158.
　　[8]Ruwhof C, van der Laarse A.Mechanical stress-induced cardiac hypertrophy: mechanisms and signal transduction pathways[J].Cardiovasc Res, 2000,47(1):23-37.
　　
　　[收稿日期]2008-03-25[修回日期]2008-05-26
　　编辑/张惠娟