[联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞增殖和形态的影响]平滑肌细胞和成纤维细胞

　　[摘要]目的：观察体外联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞形态和增殖的影响，为研究成纤维细胞和平滑肌细胞生物学特性和相互关系以及体外构建含此两种细胞的组织工程皮肤提供理论和实践基础。 方法：在体外分别分离培养成纤维细胞和平滑肌细胞并常规传代培养。模拟组织工程皮肤的结构及成纤维细胞和平滑肌细胞间的相互影响途径，按照不同比例（平滑肌细胞:成纤维细胞=1:1，1:2，1:3）建立以胶原凝胶为基质的成纤维细胞与平滑肌细胞联合培养模型。应用荧光标记、组织学观察和MTT法对平滑肌细胞的形态和代谢进行研究。 结果：联合培养模型法可以有效地建立起成纤维细胞和平滑肌细胞的相互影响模式。1:1组的成纤维细胞对联合培养的平滑肌细胞增殖有促进作用，1:3组的促增殖作用则不明显。 结论：1:1联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞增殖有促进作用，对它们体外培养和扩增以及相互关系的研究对阐明这两种细胞组合作为真皮替代物种子细胞具有重要的意义。
　　[关键词]成纤维细胞；平滑肌细胞；联合培养；组织工程；胶原
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）11-1535-03
　　
　　Effect of fibroblasts in co-culture model on smooth muscle cell proliferation and morphology
　　FENG Ya-qin 1，2，3，HUANG Sha2，YU Chun-yan1，WANG Hai-lun1，2，FENG Feng1，2，ZOU Yun-dong2，NIU Jie3，JIN Yan2
　　(1.Department of Dermatology，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University,Xi"an 710038,Shaanxi,China； 2.Center for Tissue Engineering，the Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China； 3.Weinan Convalescent Hospital of Shaanxi Military Area Command of PLA,Weinan 714000,Shaanxi,China)
　　
　　Abstract： ObjectiveTo observe the effects of fibroblasts (Fb) in vitro co-culture on morphology and proliferation of smooth muscle cells (SMC), and bio-characteristics as well as interrelation between them. To provide theoretical and practical foundation for constructing tissue engineering skin contained Fb and SMC.MethodsFb and SMC were cu1tured in vitro by dissociation and explanation of tissue individually，then implanted according different ratios（SMC : Fb=1:1，1:2，1:3）in collagen to establish co-culture model, mimicking the structure of tissue engineering skin and interaction between Fb and SMC. Morphology and metabolism of SMC was evaluated in terms of fluorescence-labeling, histological observation and MTT. ResultsCo-culture model is an effective method to establish the interaction between Fb and SMC; Fb exhibits the proliferating effects on SMC in 1:1 model of co-culture, while the effects weaken in 1:3 model. ConclusionFb plays the positive role in co-culture model (1:1) on morphology and proliferation of SMC, and the study on interaction between Fb and SMC is very important for constructing tissue engineering skin contained Fb and SMC.
　　Key words: fibroblasts; smooth muscle cells; co-culture; tissue engineering; collagen
　　
　　真皮为皮肤提供机械保护和必要的营养并决定它的外观特征，因此真皮替代物的研制是皮肤组织工程研究中的重点所在。近年来，用成纤维细胞与胶原等细胞外基质成分混合进行的三维培养，已成为制备组织工程皮肤的真皮替代物的主要方法[1]。在这样的三维培养中，成纤维细胞可产生胶原蛋白等细胞外基质成分形成真皮替代物，再和表皮细胞联合培养后形成组织工程皮肤，植入机体后经过数月甚至更长时间后才逐渐产生弹性纤维，因此，植入的组织工程皮肤在很长时间内会缺乏弹性[2]。本研究试图在模拟组织工程皮肤结构的基础上，利用平滑肌细胞更利于弹性纤维产生的优势，按照不同比例建立以胶原凝胶为基质的成纤维细胞与平滑肌细胞的联合培养模型，研究成纤维细胞和平滑肌细胞间的相互关系和生物学行为，为这两种细胞的组合作为真皮替代物种子细胞的可行性提供实验依据。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 主要试剂：磷酸缓冲盐溶液(PBS)，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸钠(EDTA)，胎牛血清(FBS)，M199培养基，DMEM培养基，谷氨酰胺，成纤维细胞生长因子(bFGF)等均为美国Gibco公司产品；胶原为Sigma公司生产；二甲基亚砜(MSOF)，四甲基噻唑二苯基四溴盐 (MTT)，四季青公司生产；CX40普通光学显微镜和CK40倒置相差显微镜和荧光显微镜(日本Olympus公司)。
　　1.2 平滑肌细胞的原代培养和体外扩增：取健康雄性小鼠(第四军医大学动物实验中心提供)，在无菌条件下迅速开胸取出心肺，分离肺动脉，将中膜剪成0.1～0.3mm2大小组织块，贴壁于培养瓶中置于37℃恒温培养箱内培养。当细胞密度接近融合时，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA消化传代，取第5代或6代的细胞用于以下实验。
　　1.3成纤维细胞的原代培养和体外扩增：取小鼠剩余皮片，尽可能彻底地修除表皮和皮下脂肪，将真皮剪成0.5～1.0mm2的组织块，接种于培养瓶内，消化下来的细胞置37℃恒温培养箱中培养4h后，再加入含150ml／L胎牛血清的DMEM培养液继续培养，每3天换液1次。原代培养细胞基本长满瓶壁后，进行传代培养。取第5代或6代的细胞用于以下实验。
　　1.4 细胞形态学观察：取第5代细胞在相差显微镜下观察细胞形态、生长状态及贴壁时间，并摄片记录。
　　1.5 MTT法测定细胞活性：取第5代平滑肌细胞和成纤维细胞分别以1:1、1:2、1:3（细胞数量为4000／孔）的比例接种于96孔培养板中，每孔加入200μl培养液于37℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养。每天同一时间点随机抽取5孔细胞，加入5％MTT 20μl/孔，培养4～6h，吸出液体，每孔加150μl二甲基亚砜振荡10min，酶联免疫测定仪测定波长490nm处的吸光度。取5孔吸光度的均值，以时间(天)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘图。
　　1.6 以胶原凝胶为基质的联合培养模型的构建：①1:1组：取生长状态良好的平滑肌细胞用Hoechst 33342标记，将其与真皮成纤维细胞按1:1比例各以1.5×106／ml的密度与3mlI型胶原(胶原浓度8mg／ml，混合前加入10%的10×DMEM 和胎牛血清，充分混匀，调节pH到7.4)混合，37℃孵育凝固后加入培养液培养5天获得组织工程真皮即平滑肌细胞与成纤维细胞的联合培养模型；用HE染色和荧光显微镜观察构建的模型中平滑肌细胞的形态和分布；②1:2组和1:3组以不同数量的成纤维细胞代替，其余处理及检测同1:1组。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 细胞形态观察：光镜下观察，第5代培养的平滑肌细胞呈细长梭形(图1)，成纤维细胞呈细长形、扁平星状结构(图2)，均处于功能活跃状态。
　　
　　2.2 MTT法测定细胞代谢活性：MTT检测结果显示（图3），平滑肌细胞和成纤维细胞在1:1的比例时，平滑肌细胞的增殖较快，代谢较为活跃（P＜0.05）；在成纤维细胞比例增加时（SMC : Fb=1:2、1:3），平滑肌细胞的活性一般，增殖作用不明显（P＞0.05）。
　　
　　2.3共培养模型的大体观察：大体观察含两种细胞的共培养模型（图4），所见结果与常规培养的组织工程真皮在色泽、质地等方面未见明显差别[3]，然而由于所用平滑肌细胞和成纤维细胞比例不同，含较高比例的平滑肌细胞的皮肤模型（1:1）的外观明显好于含平滑肌细胞比例较低 (1:2、1:3) 的皮肤模型，尤其是1:3组模型的边缘收缩较为明显。
　　
　　2.4共培养模型的组织学观察：HE染色结果显示，1:1组的细胞明显较其它组多，细胞密度较大。梭形细胞体积较大，核大、淡染，核仁明显，表明此时细胞的合成功能很活跃。而1:3组的细胞体积较小，核深染、核仁不明显，胞质少，各组合成的共培养模型都具有真皮替代物的结构(图5)。
　　本实验采用Hoechst 33342标记平滑肌细胞的方法对共培养模型中成纤维细胞对平滑肌细胞的影响进行了分析。荧光显微镜下各组模型所形成的真皮层均能观察到标记为蓝色荧光的平滑肌细胞分布（图6）。
　　
　　3讨论
　　
　　随着细胞培养技术的发展和组织工程学的兴起，皮肤组织的体外重建正由设想变为现实。近年来，国内外已有不少学者将体外培养的皮肤替代物移植应用于临床修复创伤皮肤缺损创面[4-5]。由成纤维细胞作为种子细胞构建的真皮替代物具有较强的生物活性，不引起免疫排斥反应，而且可促进表皮细胞生长及表皮真皮连接形成，改善移植物的物理性能和美观效果。然而这样构建的真皮替代物植入机体后，往往需要在数月至2年后才逐渐产生弹性纤维。已有文献证实平滑肌细胞与胶原等多糖基质混合培养后可产生弹性纤维[6]。因此，我们考虑将平滑肌细胞也作为种子细胞引入真皮替代物的构建，进一步改善皮肤替代物的功能性。在本实验中，笔者将重点放在观察体外联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞形态和增殖的影响上，以此证实这两种细胞的相互关系和共同作为种子细胞体外构建组织工程皮肤的可行性和潜能。
　　实验结果显示，以胶原凝胶为基质建立的联合培养模型法，可有效评估成纤维细胞对平滑肌细胞的影响。1:1组的成纤维细胞对联合培养的平滑肌细胞有明显促增殖作用，1:3组的成纤维细胞比例过高，促增殖作用反而不明显。显微镜观察可见，平滑肌细胞在1:1联合培养组所构建的真皮替代物中分布均匀，细胞体积与胞核均较大，提示该细胞的合成功能活跃，这可能与成纤维细胞分泌的各种生长因子的作用有关。但成纤维细胞比例的增加，对平滑肌细胞的增殖作用反而会减弱，因此探讨合适的培养比例对它们联合培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。综上所述，通过观察联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞增殖和形态的影响，笔者认为用1:1联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞增殖有促进作用，这两种细胞的组合有望共同作为种子细胞构建一种新的真皮替代物。
　　
　　[参考文献]
　　[1]杨颖藕, 于淑贤, 贾继章, 等．利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究 [J]. 中国修复重建外科杂志，2003，17(4)：339-342.
　　[2]Shakes P. Bum wound healing and skin substitutes[J]. Burns, 2001, 27 (4)：517-522.
　　[3]胡葵葵, 戴育成, 袁敬东. 组织工程活性真皮的构建研究[J]. 西安交通大学学报：医学版，2006,27（2）：117-119.
　　[4]Heimbach DM, Warden GD, Luterman A, et a1. Multicenter postapproval clinical trial of Integra(r)dermal regeneration template for burn treatment[J]．J Burn Care Rehabil，2003,24(1)：42-48.
　　[5]Hu M, Sabelman EE, CaoY, et a1. Three-dimensional hyalurc acid grafts promote healing and reduce scar formation in skin incision wounds[J]. J Biomed Mater Res, 2003,15: 586-592.
　　[6]Yu LX, Zou ZH. Aortic smooth muscle cells produced elastic fibers in three-dimentional culture [J]. Acta Anatomica Sinica, 2004, 35(1): 74-78.
　　
　　[收稿日期]2007-06-21[修回日期]2007-10-21
　　编辑/张惠娟