非编码区突变属于基因突变吗 [Ｍｓｘ１编码区突变与非综合性唇腭裂相关性分析]

　　[摘要]目的：探讨核心家庭中Msx1编码区突变与非综合征性唇腭裂的关系。方法：运用测序技术检测华东地区核心家庭的Msx1基因全部编码区的突变情况，预测其编码氨基酸的突变频率,比较突变位点在患儿与正常儿童中的分布差异并判断是否有统计学意义，比较患者组与父母组的基因型和等位基因频率，并对核心家庭的数据进行单倍型相对风险分析(HRR)，对含杂合子父母的核心家庭进行传递不平衡检验(TDT)。结果：Msx1编码区序列共有三个位点突变，分别为编码区1的C101G（A34G）突变，编码区1同义突变 C330T（G110G），编码区2 的G162A（S278N）突变。其中只有编码区1的同义突变C330T（G110G）在患儿与正常儿童中的分布差异有统计学意义，患者与其父母各位点基因型和等位基因分布差异无统计学意义(P＞0.05)，HRR结果和TDT结果无统计学意义，另外两个突变位点各项统计均无统计学意义。结论：编码区1的同义突变C330T（G110G）可能与中国华东人群非综合征性唇腭裂存在相关性，而编码区1的C101G（A34G）突变和编码区2 的G162A（S278N）突变与中国华东人群非综合征性唇腭裂不存在相关性。
　　[关键词]非综合征型唇腭裂；Msx1；编码区；突变；测序
　　[中图分类号]R782.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-04
　　
　　Association of mutations in coding regions of Msx1 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate by DNA sequencing technology
　　WU Xuan1,CUN Min-gui2,ZHOU Xiao-ping2,LIU Jia-yin2,WAN Wei-dong1
　　(1.Department of Plastic Surgery,Zhongda Hospital,Southeast University, Nanjing 210009, China;2.The Center of Clinical Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029，Jiangsu, China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between mutations in coding regions of Msx1 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P)in nuclear families consisting of fathers, mothers and affected offspring with NSCL/P from southeast China.MethodsAll mutations in coding regions of Msx1 were detected by applying sequencing technology in nuclear families, predicting mutation frequency of amino acid, comparing the distributional difference of affected offspring and unimpaired child and judge that if it has the statistical significance.Then compare the genetype and allele frequency in affected offspring and fathers. Haplotype Relative Risk (HRR) and Transmission Disequilibrium Test (TDT) were performed.ResultsThere were three mutational sites in all ，mutation C101G（A34G）and samesense mutation C330T（G110G）in coding region1, mutation G162A（S278N）in coding region2. Only samesense mutation C330T（G110G）in coding region1 has significant difference in genotypes and alleles distribution between patients and normal.No significant difference in genotypes and alleles distribution between patients and their parents.were found. They all got negative results in both HRR and TDT analysis.The other two mutational sites had no significant results in all above.ConclusionThere may have some relationship between Samesense mutation C330T（G110G）in coding region1and NSCL/P in population from southeast China but mutation C101G（A34G）in coding region1and mutation G162A（S278N）in coding region2 have no significant relationship in population from southeast China.
　　Key words:nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate(NSCL/P); Msx1 gene; coding regions; mutation; sequencing
　　
　　先天性唇腭裂是人类最常见的先天性畸形之一，国内外研究认为非综合征性唇腭裂的发病与多基因遗传、环境及两者的相互作用相关，目前已选出多个候选基因，Msx1就是其中的一个。因地区环境和种族差异的影响，这个基因在不同文献的结果不尽一致。Msx1全基因序列总共只有两个编码区（本文中命名为编码区1和编码区2），本项研究拟采用测序技术在华东地区人群中检测此基因全部编码区的突变情况,预测其编码氨基酸的改变,进一步探讨这个基因与NSCL/P的关系。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1对象：共有50个核心家庭和50个正常对照，患儿为经整形外科医师确诊的非综合征性唇腭裂（NSCL/P）患者，均已排除了综合征性唇腭裂如Van Der Woude综合征、Meckel综合征、歌舞伎面谱综合征、腭心面综合征。核心家庭患者年龄分布为1～14岁，平均2.96岁，其中单纯唇裂男女患者各有10例和5例，唇裂伴腭裂的男女患者各有24例和11例。患者及其父母来自东南大学附属中大医院、江苏省人民医院和南京市儿童医院的住院病人，研究对象均为华东地区汉族人，且均对本项研究签署了知情同意书。
　　1.2 DNA提取：按PUREGENE DNA 纯化试剂盒的说明书 （美国GENTRA公司）抽提外周血白细胞基因组DNA。
　　1.3 PCR扩增：参照NCBI 基因库公布的Msx1基因序列设计扩增引物, 引物均由上海英骏生物公司合成,编码区1扩增选用大连宝生物公司的LA Tag高保真酶,编码区2扩增采用南京天为公司pfu高保真taq酶。扩增引物由Primer Primer 5.0软件设计。编码区1上游引物(5"-3") 为tggccagtgctgcggcagaa，下游引物(5"-3") 为gttccagacctcctcgcctt，扩增片段长度为701bp；编码区2上游引物(5"-3") 为tgtggacatcgagccttcaa，下游引物(5"-3") 为cactctccgaagtctgatcc，扩增片段长度为877bp。编码区1 GC含量高达73.5％，加入GC Buffer可以降低解链的难度，提高PCR效率，其反应体系为LA Taq 0.3μl，2×GC Buffer25μl，DNTP 8μl，Primer F1μl，Primer R 1μl，DNA模版1μl，加去离子水至50μl；反应条件为94℃1 min，94℃30s、60℃30s、72℃2 min计30个循环，72℃10 min。编码区2反应体系为2×master mix 25μl,Primer F2μl, Primer R 2μl, DNA模版1μl,加去离子水至50μl；反应条件为94℃3 min，94℃30s、55℃30s、72℃1min计30个循环，72℃5min。
　　1.4 纯化测序：编码区1GC含量高达73.5％，纯化测序由上海英骏公司完成。编码区2GC含量57％，由上海博亚公司完成。对发现阳性结果的核心家庭进行重复测序，以检测测序结果的可靠性，若两次结果不一致，再进行双向测序，保证测序结果的可信度。编码区1正向测序引物为tggccagtgctgcggcagaa，反向测序引物为tggtcctcgggagcccag；编码区2正向测序引物为tcatgctccaatgcttctct，反向测序引物为cccatgtcgtggtcccga，测序引物由测序公司设计和合成。
　　1.5 测序结果判读：用Chromas软件对测序锋图进行分析，判断杂合子和纯合子，从而得到核心家庭的基因序列，用Dnastar软件对核心家庭的基因序列与Pubmed提供的正常序列进行比对，以发现突变位点。
　　1.6 统计学分析：患儿组与对照组做病例对照研究的卡方检验；患儿组与父母组基因型分别做Hardy-Weinberg平衡检验。对核心家庭的父母及患者做各位点基因型及等位基因频数比较，和单体型相对风险分析（Haplotype Relative Risk, HRR）。选取亲代至少有一位是杂合子的核心家庭作传递不平衡检验（transmission disequilibrium test, TDT）。统计由Stata9软件完成。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 PCR产物凝胶电泳：编码区1PCR产物长度为701bp，PCR产物凝胶电泳图如图1，编码区2 PCR产物长度为877bp，PCR产物的凝胶电泳如图2。
　　2.2测序结果
　　2.2.1编码区1：图3是一患儿的部分测序峰图，图上可见第115号位点是个双峰，该位点为杂合子，基因型为G/C杂合型，而该位点对应的是编码区1的101号位点，即该患者编码区1的101号位点为G/C杂合型。图4上可见343号位点也是个双峰，为杂合子，基因型为T/C杂合型，而该位点对应的是编码区1的330号位点，即该患者编码区1的330号位点为T/G杂合型。图5上可见该患者第115号位点和344号位点都为双峰，分别对应为编码区1的101号位点和330号位点，说明该患者此两个位点的突变是连锁性突变。
　　2.2.2编码区2：编码区2在父母中未发现突变的基因型，在一例患儿中发现有G162A突变。
　　2.3 患儿与正常人基因型差异的卡方检验：①表1所示为101位点患儿与正常对照得基因型分布，代入卡方检验公式，得卡方值χ2=0.92，对应P值＞0.05，无统计学意义；②表2所示330位点患儿与正常对照组的基因型分布，代入卡方检验公式，其中T=6×50/100=3,1＜T＜5,n=100＞40,用计算校正的卡方值，计算得χ2=4.43，对应P值＜0.05，有统计学意义。
　　2.4患儿组与父母组各位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），各位点两组间基因型及等位基因频数皆无统计学差异，见表3与表4
　　2.5 HRR分析：C101G与C330T两位点各自两个等位基因在传递与未传递例数比较中差异无统计学意义，P＞0.05。见表5。
　　2.6 TDT结果：各位点以患者染色体等位基因为病例组，患者父母未传递给患者的等位基因为内对照，进行病例内对照研究，经检验，此两位点P值均＞0.05，无统计学意义，见表6。
　　2.7 编码氨基酸突变：Msx1基因一共只有两个编码区，即编码区1和编码区2，通过以上编码区基因的突变，我们可以得出Msx1编码的氨基酸序列的变化，但由于突变率较低，都没有统计学意义。见表7。
　　
　　3讨论
　　
　　非综合征性唇腭裂是一种常见的先天性颜面部缺陷，世界各地发病率从1/500到1/2500不等，目前被认为是多基因遗传病。Msx1是最近研究的热点之一。
　　Msx1基因是同源异型盒基因家族的成员之一，它作为核转录因子，是器官发育过程中的主调控基因，亦是颌面发育的重要转录因子，其基因突变可导致唇裂、腭裂等严重先天性畸形。Msx1编码区的exon1编码150个氨基酸，exon2编码147个氨基酸，编码区多态性致氨基酸变异大多集中在exon1。Jezewski[1]等对Msx1进行测序分析时发现的氨基酸突变有, E78V,G98E,G110GV，114G,G116E，L118L。同时证实同义突变G110G（c＞t）在亚洲人群的非综合性唇腭裂中有显著意义。缺失突变（811－816缺失）在Iowa州人群中与非综合性唇腭裂的关联性亦被发现，具有统计学意义。Yasushi Suzuki[2]等在对一组越南NSCL/P核心家庭研究时发现Msx1基因中两种错义突变，P147Q和G98E。其中P147Q，即该基因的第一个外显子第440个碱基由C变为A，此人群中2%的患者有这种点突变，有统计学意义。Tongkobpetch S[3]等对100名泰国非综合性唇腭裂患者的Msx1编码区进行分析,在外显子2编码区的羧基末端新发现了两个突变G267C，P278S，而在162名对照组中没有发现此两种突变。Jungyong Park[4]等以52名韩国非综合性唇腭裂患者为对象，对Msx1基因内部及其周围9.8kb长度的序列进行了测序分析，结果发现了7个snp位点，其中位于exon2的第7个SNP,1170G/A在韩国非综合性唇腭裂人群中有着显著意义。Vieira[5]等对智利45个NSCLP家系进行研究,发现MsxI基因两个错义突变(G16D和G34A), G16D突变可能破坏了一个剪接位点，导致唇腭裂的形成。De Muynck[6]等研究发现，在一个唇聘裂家系的3个个体中发现一个新的MsxI突变,C559T,导致编码氨基酸由谷氨酸转变成终止信号。
　　本研究采用传统的病例对照设计和核心家庭的病例父母对照研究，进行了 HRR分析和TDT检验，以患者父母为内对照，可避免关联研究中存在的不恰当的对照问题。其中TDT不受遗传方式、群体不纯、分层的限制而成为研究核心家庭遗传标志与疾病易感位点关系的首选方法。本实验的结果表明，编码区1的同义突变G110G（C330T）有统计学意义，与Jezewski等在亚洲人群中的研究结果一致，证实其在中国华东人群非综合征性唇腭裂中存在一定相关性。A34G（C101G）的突变在Vieira等对智利45个NSCLP家系的研究中也发现了，但在本实验研究的中国华东人群非综合征性唇腭裂中无统计学意义。编码区2的G162A（S278N）突变在本实验研究对象中只发现了一例，无统计学意义。我们的研究结果与国内外同类报道不尽一致,可能主要与基因存在种族和地区的差异性相关。
　　Msx1编码由297个氨基酸组成的蛋白质。人类连锁和连锁不平衡研究发现, Msx基因特殊编码序列的突变,可能会使Msx编码蛋白缺失,从而引起其功能不足,导致远端面芽萌出缺乏,随之发生一期或二期腭裂[7]。突变Msx1蛋白缺乏N端结构域,无法调节细胞周期素(cyclin D1),故抑制分化[8]。对Msx1基因编码的转录因子如何调节细胞内信号级联反应并介导诱导组织间相互作用,下位靶基因及其对器官发生中相关细胞过程的确切作用机制等方面的进一步研究,将为阐明疾病的分子生物学机制,以及临床开展非综合性唇腭裂患者的产前诊断、早期基因修正、孕期外源性生长因子治疗等研究,奠定理论基础,为患病人群及后代提供预警和遗传风险的评估和咨询，据此建立有效的预防和干预措施。
　　
　　[参考文献]
　　[1]JezewskiP A,VieiraA R,NishimuraC,et al. Completes equencing shows a role for MSXI in non-syndromic cleftlip and palate[J].Med Gene,2003,40:399-407.
　　[2]Suzuki Y, Jezewski PA, Machida J, et al. In a Vietnamese population, Msx1 variants contribute to cleftlip and palate[J]. Genet Med,2004,6:117-125.
　　[3]Tongkobpetch S, Siriwan P, Shotelersuk V. Msx1 mutations contribute to nonsyndromic cleft lip in a Thai population[J]. J Hum Genet,2006,51(8):671-676.
　　[4]Park J, Park BY, Kim HS,et al.Msx1 Polymorphism Associated with Risk of Oral Cleft in Korea: Evidence From Case-Parent Trio and Case-Control Studies[J].Yonsei Med J, 2007,48 (1):101-108.
　　[5]Vieira AR,Castillo TS,Aravena T,et al.Mutationala nalysis of the muscles egment homeoboxg ene1 (Msx1)inC hileanp atients with cleft lip/palate[J].Rev Med Chil,2004,132:816-822.
　　[6]De Muynck S,Schotlen E,Matthjs G,et al.A novel Msx1 mutation in h- ypodontia[J]. Am J Med Genet A,2004,128:401-403.
　　[7]Satokata I, MaasR. Msx1deficientmice exhibitcleftpalate and abnormalities of craniofacial and tooth development[J]. NatGenet, 1994,6:348-356.
　　[8]Hu G,LeeH,Price SM,et al. Msx homeobox genes inhibit differentiation through upregulation of cyclin D1[J]. Development, 2001,128:237-238.
　　
　　[收稿日期]2007-12-09[修回日期]2008-03-06
　　编辑/张惠娟
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”