注射用A型肉毒毒素怎么样【Ａ型肉毒毒素对神经和肌肉影响的效价研究】

　　[摘要]目的：探讨新鲜和储存的A型肉毒毒素（BTXA）对神经及肌肉的影响，以期指导临床治疗。方法：将27只新西兰白兔随机分成9组,选择耳前肌为注射部位。第1组为对照组，余8组为注射组。各注射组接受BTXA的注射，大体观察各组实验动物右耳下垂的情况；并均于注射后第5天（早期）和第12周（晚期）取注射的肌肉神经行电镜观察。结果：大体观察结果：随储存时间的延长，兔耳下垂的时间越短。肌肉电镜观察结果：在注射后早期（第5天），新鲜及储存的BTXA对肌肉的影响无显著性差异；在注射后晚期（第12周），新鲜及储存1～2周的BTXA比较，两者造成的肌肉萎缩程度无显著性差异，但储存3周的BTXA造成的肌肉变性程度比储存1～2周的BTXA轻。神经电镜观察结果：BTXA注射后神经改变与上述肌肉改变同。结论：储存1～2周的BTXA与新鲜BTXA比较，两者效价基本相同，但储存3周的BTXA效价下降显著。并且，新鲜BTXA及储存1～2周的BTXA对神经肌肉的影响时间较储存3周的BTXA更持久。因此本实验建议临床上储存BTXA的时间不超过2周。
　　[关键词]A型肉毒毒素；超微结构；变性；大体观察
　　[中图分类号]R888.8[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）06-0859-05
　　
　　Study on the effects of botulinum toxin A on muscle and nerve
　　CHEN Jun-nan，SONG Jian-xing,LI Zhi-hua
　　（Department of Plastic Surgery, Changhai Hospital, the Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200433，China）
　　
　　Abstract:ObjectiveThe aim of the study was to compare the effects of fresh and stored botulinum toxin A on muscle and nerve, by means of which the clinical treatment can be instructed.Methods27 New Zealand white rabbits were divided into 9 groups, and anterior auricular muscle was used for injections. Group 1 was used as the control group and the rest 8 groups were used as the injection groups. Each group received the injection of BTXA inspite of the control group. Each rabbit had weekly visual evaluation of the maximum erect static position of the right auricle. Muscles and motor nerves were harvested at 5 days (early period) and 12 weeks (late period) respectively after BTXA injection. Alterations in muscle and nerve ultrastructure were evaluated with electron microscopy.ResultsThe visual evaluation results showed that there was an overall quicker trend to return to baseline the longer the BTXA was stored.Degeneration findings in muscle after botulinum toxin injection revealed no significant difference between freshly reconstituted and stored toxin in the early period (the fifth day). When stored (for 1 and 2 weeks) toxin was used, atrophic changes in the muscle were the same as the fresh toxin at 12 weeks. Muscles of the group which was injected BTXA stored for 3 weeds had less severe degenerative findings than group which was injected with BTXA stored for 1 and 2 weeks muscles. On nerve evaluation, the changes on nerve ultrastructure shows similar degeneration as the muscle.ConclusionIt seems that stored BTXA for 1 weeks and stored BTXA for 2 weeks has the same initial potency, but the duration of action significantly decreased when BTXA was stored for 3 weeks or more. Stored (for 1 and 2 weeks) and fresh BTXA are more durable than the stored BTXA for 3 weeks. Hence, we command that the time for the storage of BTXA should better be shorter than 2 weeks.
　　Key words: botulinum toxin A；ultrastructure；degeneration；visual study
　　
　　A型肉毒毒素（botulinum toxin A，BTXA）是由专性厌氧性细菌肉毒梭菌产生的一种神经毒素[1]。它能选择性作用于外周胆碱能神经，在神经肌肉接头（即突触）处[2-3]，抑制突触前膜释放乙酰胆碱（Ach）[4]，并阻断神经递质的传递，从而引起肌肉的松弛性麻痹。
　　现在市面上使用的肉毒毒素剂型有：美国Allergan公司生产的A型肉毒毒素商品名为BOTOX。英国Speywood公司生产的一种A型肉毒毒素商品名Dysport。我国于1997年正式被国家批准的“注射用A型肉毒毒素”投放市场（97卫药 准字（兰）S-01号），商品名为“衡力”。肉毒毒素制造商建议：根据制品特性， 应将BTXA放在-20℃～-5℃冰箱内保存，用生理盐水稀释后宜在4h内使用，否则影响效价[5-8]。由于小剂量的BTXA即可产生巨大效应，如此会有相当一部分BTXA剩余，造成制剂的浪费，处理不当更会污染环境。近年来国外一些研究机构对新鲜和储存BTXA效价进行了对照研究。Gartlan和Hoffman[9]报道储存BTXA的效价明显低于新鲜BTXA；另有一些研究表明储存的BTXA效价未受影响[10-12]。上述研究多是从药理试验等方面的影响，几乎没有针对神经、肌肉直接作用点方面的研究。储存的BTXA的效价和作用时间是否受到影响值得进一步深入研究。因此，本实验针对这方面在动物身上进行实验，研究新鲜和储存BTXA对神经肌肉超微结构的影响，以期为今后临床应用提供可靠依据。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 材料
　　1.1.1 试剂和药物：A型肉毒毒素由兰州生物制品研究所研制，商品名为“衡力”，冻干结晶肉毒毒素，规格为100U/瓶，批号：20060602；75%乙醇等化学试剂均购自上海长海医院。
　　1.1.2 动物：新西兰白兔，普通型，健康，雄性，体重1.5～2kg，由上海第二军医大学实验动物中心提供。
　　1.1.3 仪器：LKB-Ⅱ超薄切片机，瑞士制造；日立H800透射电子显微镜，日本制造。
　　1.2 方法
　　1.2.1 动物分组：新西兰白兔27只，实验前一周购入，单笼喂养，混合饮食，自由饮水与摄食。平均体重为1.80kg。术前常规禁食。房间温度保持在20℃～25℃。供实验的动物被随机分成9组，每组3只，建立对照，各组动物均取右耳注射，左耳为正常参照。具体为：①第1组（n=3，对照组）：取右侧耳前肌注射0.05ml生理盐水；②第2组（n=3）：取右侧耳前肌注射新鲜BTXA 0.05ml（2.5 U），注后第5天处死，取标本行电镜观察；③第3组（n=3）：取右侧耳前肌注射储存1周的BTXA 0.05ml（2.5U），注后第5天处死，取标本行电镜观察；④第4组（n=3）：取右侧耳前肌注射储存2周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后第5天处死，取标本行电镜观察；⑤第5组（n=3）：取右侧耳前肌注射储存3周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后第5天处死，取标本行电镜观察；⑥第6组（n=3）：取右侧耳前肌注射新鲜BTXA 0.05ml（2.5U），注后12周处死，取标本行电镜观察；⑦第7组（n=3）：取右侧耳前肌注射储存1周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后12周处死，取标本行电镜观察；⑧第8组（n=3）：取右侧耳前肌注射储存2周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后12周处死，取标本行电镜观察；⑨第9组（n=3）：取右侧耳前肌注射储存3周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后12周处死，取标本行电镜观察。
　　1.2.2 模型制作：新西兰白兔耳前肌为注射部位，耳前肌的起始处附着于同侧额骨，距离内眦约2cm，止于同侧耳朵腹内侧肌缘（距耳基底3cm左右），其最小安全剂量为2.5U[12]。实验组各组动物于注射前腹卧位将其四肢固定于操作台上。手术前用手术剃刀蘸取肥皂液刮除动物耳周体毛，后用清水冲洗，75%乙醇消毒术区。除对照组，其余各实验组新西兰白兔均取右侧耳前肌注射BTXA，每安瓿含100U，使用前用生理盐水2ml稀释配置成50U/ml。配好制剂即刻注射，剩余储存于4℃冷藏箱内，储存时间依次是1、2、3周。
　　以上实验动物耳前肌肌肉、神经于注射BTXA后的第5天和第12周做耳前肌处纵行切口，钝性分离，垂直切断取出。取下的耳前肌及神经均置于4%多聚甲醛固定4h以上；后将组织用磷酸缓冲液（PBS）0.1mol/L漂洗；锇酸1%固定2h后用PBS漂洗；梯度（30%、50%、70%、90%及100%）丙酮脱水；用环氧树脂包埋、聚合等；LKB-Ⅱ超薄切片机切片，最后行日立H800透射电子显微镜观察。
　　1.2.3 观察内容：对照组及第6、7、8、9组行大体观察，每周观察一次，记录新西兰兔耳下垂的情况，兔耳位置分级共分3级，级别依次是第1、2、3级，观察时间12周。
　　分别观察实验组和对照组的神经、肌肉标本，实验组与对照组、不同实验组之间两两比较。肌肉萎缩指标包括A-I带溶解/消失、Z线溶解/消失、细胞核迁移、肌原纤维溶解和肌纤维变性等[13]。神经的华勒(氏)变性指标包括髓鞘松散/溶解、Schwann细胞浆变性、轴索松散/溶解、无髓神经松散/溶解和基质变性等。上述样本采用半定量评分系统[13]评估变性的数量和程度。未观察到任何变性计0分；观察到明显的变性计5分。
　　1.2.4 数据分析与统计学处理：对大体观察结果采用方差和t检验（variance and t test）进行统计学处理；应用SAS统计软件，对电镜观察结果采用卡方检验（ Kruskal-Wallis Test）进行统计学处理，P＜0.05有统计学意义。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 大体观察结果：同对照组比较，注射BTXA的实验动物（第6～9组）在早期，注射耳均见明显下垂，等级为第3级（图1）。之后每周观察兔耳下垂情况并记录，连续观察12周。统计每组的平均恢复时间：第9组的平均恢复时间是5.67周，第8组为7.0周，第7组为8.0周，第6组为9.33周（图2）。大体观察结果：BTXA的储存时间越长，下垂的兔耳恢复越快。2.2 肌肉电镜观察结果：①对照组（第1组）的耳前肌肌肉结构正常，无变性表现（P＞0.05）（图3）；②第2组同第1组比较表现为明显的肌肉变性（P=0.0027）（图4）；③第3组同第1组比较表现为明显的肌肉变性（P=0.0047）；④第4组同第1组比较表现为明显的肌肉变性（P=0.0047）（图5）；⑤第5组同第1组比较表现为明显的肌肉变性（P=0.0046）；⑥第2组同第3组比较，二者肌肉变性程度无显著差别（P＞0.05）；⑦第3组和第4组比较，电镜观察的超微结构变化结果同上（P＞0.05）；⑧第4组比第5组表现为更显著的肌肉变性（P=0.0486）；⑨第6组（新鲜晚期组）同第1组比较：注射新鲜BTXA 12周后该组耳前肌肌肉仍有变性表现（P=0.0039）（图6）；⑩第7组同第1组于注射后12周比较，仍见肌肉变性（P=0.0168）；⑾第8组和第1组对比表现结果同上（P=0.0050）(图7)；⑿第9组和第1组对比表现结果同上（P=0.0168）；⒀第6组和第7组比较，后者肌肉变性的程度较前者轻（P=0.0177）；⒁第7组同第8组比，后者肌肉变性的程度较前者轻（P=0.0486）；⒂第8组同第9组比，表现同上（P=0.0486）。肌肉变性标准评分见表1。
　　
　　2.3神经电镜观察结果：①对照组的耳前肌神经结构正常，无变性表现（P＞0.05）（图8）；②第2组同第1组比较表现为明显的神经变性（P=0.0027）（图9）；③第3组与第1组比较表现同上（P=0.0047）；④第4组与第1组比较表现同上（P=0.0047）（图10）；⑤第5组同第1组比较表现同上（P=0.0046）；⑥第2组和第3组比较，二者的神经变性无显著差别（P＞0.05）；⑦第3组和第4组比较，电镜观察的超微结构变化结果同上(P＞0.05)；⑧第4组和第5组比较表现为较显著的神经变性（P=0.0486）；⑨第6组和第1组比较：注射新鲜BTXA 12周后该组耳前肌神经仍有变性表现（P=0.0039）（图11）；⑩第7组同第1组于注后12周比较，仍见神经变性（P=0.0177）；第8组和第1组对比表现结果同上（P=0.0027）(图12)；第9组和第1组对比表现结果同上（P=0.0495）； 第6组和第7组比较，两者神经变性无明显差别（P>0.05）；第7组同第8组比，结果同上（P>0.05）；第8八组同第9组比，第9组耳前肌神经变性程度轻于第8组（P=0.0046）。神经变性标准评分见表2。
　　
　　
　　3讨论
　　
　　BTXA为临床注射用制品，是由极微量的BTXA加入适当保护剂冻干而成，为白色疏松体，用生理盐水溶解后为无色透明或淡黄色溶液，无杂质及不溶物。临床上，一般将BTXA保存于-20℃～-5℃冰箱中，以避免其药物效价受到影响。
　　迄今，BTXA制品的效价仍用小白鼠体内实验法测定，即以生物鼠单位来表示。所谓一个单位（U）的BTXA，是指能使腹腔注射的一只18～20g Swiss-Webster 小鼠死亡50%的毒素量，即1只小鼠LD50或简称1个单位（U）。
　　制造商规定：BTXA必须保存在-5℃～-20℃的环境中，使用和操作的过程中应尽可能的保持低温环境，以减少BTXA生物学活性的损失。新鲜配置的BTXA若未在配后4h内使用，其效价及药物活性持久度会明显降低。但近年来，越来越多的研究证实了储存一定时间的BTXA，其生物学活性未受明显影响。1993年，Gartlan与Hoffman做过新鲜BTXA和储存时间分别为6h和12h的BTXA的对比实验[9]；1996年，Garcia和Fulton也做过类似的对照实验[14]，将新鲜配好的BTXA与储存时间依次为1、2和 4周的BTXA对比，通过物理检查等方法主观评价了BTXA治疗的病人，得出新鲜与储存BTXA在效价上无明显差别的结论。1997年，Sloop[10]等人也做过类似实验，实验对象为8位病人的指(趾)短伸肌，行肌电图描记结果，得出新鲜与储存2周的BTXA的效价无显著性差异的结论。Jabor[12]等人用新西兰白兔模型来比较新鲜和储存BTXA的效价。此项实验将新鲜BTXA与分别储存了2、6、12周的BTXA比较，采用电生理学等实验方法，得出新鲜和储存的BTXA原始效价基本一样的结果；储存12周的BTXA未发现任何细菌污染。
　　前人做过的皆是有关BTXA功能、生理上的实验研究，并未有针对BTXA注射后神经、肌肉超微结构变化的实验研究，且均无明确说明储存时间与药物效价、作用时间的关系。参阅以上实验，并结合大多数医院药物储存条件及药物活性的改变时间，本实验着重研究储存时间在三周内的BTXA，选取大体观察、电镜观察的实验方法，从神经肌肉的超微结构变化处着手，较直观的研究了BTXA作用时间及对神经肌肉的影响。
　　本实验采用新西兰白兔耳前肌为实验模型[12]，理由是位置表浅、注射方便，可直观观察其静态及动态变化。并且，耳前肌是支配兔耳肌肉中唯一可以耐受药物重复注射的一束单独的肌肉。已有文献[15]证实BTXA 的最小有效安全剂量是2.5U，该剂量可造成兔耳耳前肌的完全麻痹。因此，本实验对照组注射的生理盐水剂量及各实验组耳前肌注射的BTXA剂量相同，均为0.05ml。
　　大体观察结果：观察各个实验组动物的耳下垂情况，并进行等级评估，观察时间为12周，第9组的平均恢复时间最短，为5.67周，第8组为7.0周，第7组为8.0周，第6组为9.33周。所有实验组的耳下垂情况在BTXA注射后的第9周均基本恢复注射前的水平。
　　肌肉电镜观察结果：注射新鲜BTXA的肌肉在早期有明显变性改变，包括胞核移位、固缩；A、I带及Z线溶解； 肌原纤维溶解；线粒体变性等。新鲜BTXA注射的肌肉超微结构在注射后第12周仍有变性表现，但变性程度轻。说明：新鲜BTXA的效价在注射后3月内对肌肉的影响持续存在，并且以后逐渐恢复。
　　注射冷藏于4℃的冰箱，储存时间分别为1、2、3周的BTXA的肌肉改变如下：注射早期（第5天），三者的肌肉萎缩均较明显，在注射后晚期（第12周）仍有变性表现，但变性程度减轻。说明储存BTXA在注后12周内对肌肉的影响持续存在，以后呈逐渐恢复的趋势。
　　将储存时间依次是1、2、3周的BTXA同新鲜BTXA比较，表现如下：注射后早期（第5天），新鲜及储存BTXA的肌肉均有明显变性的表现；注射后晚期（第12周），储存1、2周的BTXA与新鲜BTXA比较，两组肌肉变性程度相似；但是注射储存3周BTXA后，其肌肉的变性程度较储存1、2周的BTXA轻，说明储存3周的BTXA，随储存时间的延长，其对肌肉的影响时间越短，变性肌肉恢复越快。
　　神经电镜观察结果：注射新鲜BTXA后神经超微结构有明显改变，包括髓鞘松散、肿胀；轴突松散；许旺细胞胞浆变性；无髓神经的溶解消失；基质变性等。并在注射后12周仍有变性表现，但变性程度轻，说明新鲜BTXA在注射后3个月内对神经的影响持续存在，并呈逐渐恢复的趋势。
　　注射冷藏于4℃的冰箱，储存时间分别为1、2、3周的BTXA的神经改变如下：注射早期（第5天），三者的神经萎缩均较明显，在注射后晚期（第12周）仍有变性表现，但变性程度减轻。说明储存BTXA在注后12周内对神经的影响持续存在，以后呈逐渐恢复的趋势。
　　将储存时间依次是1、2、3周的BTXA同新鲜BTXA比较，表现如下：注射后早期（第5天），新鲜及储存BTXA的神经均有明显变性的表现；注射后晚期（第12周），储存1、2周的BTXA与新鲜BTXA比较，两组神经变性程度相似；但是注射储存3周BTXA后，其神经的变性程度较储存1、2周的BTXA轻，说明储存3周的BTXA，随储存时间的延长，其对神经的影响时间越短，变性的神经恢复越快。
　　
　　4结论
　　本课题研究是从BTXA的效价、活性及作用时间的角度出发，设计新西兰白兔耳前肌的动物模型，应用大体观察及电镜超微结构观察的方法，就新鲜及储存BTXA对神经肌肉影响进行对照研究，探讨BTXA的储存时间与药物效价、作用时间的关系。通过大体观察实验得出的研究结果表明：随储存时间的延长，兔耳下垂的时间越短。通过电镜观察实验得出的研究结果表明：储存1～2周的BTXA与新鲜BTXA比较，两者效价基本相同，但储存3周的BTXA效价下降显著。并且，新鲜BTXA及储存1～2周的BTXA对神经肌肉的影响时间较储存3周的BTXA更加持久。因此，本实验建议临床上储存BTXA的时间不宜超过2周。
　　
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　　[收稿日期]2008-03-15[修回日期]2008-05-29
　　编辑/张惠娟