基于代谢组学研究长期慢性酒精暴露对大鼠氨基酸代谢途径和神经递质水平的影响

李晓琳，刘舒静，陈子恺，孔琬，黄善情，倪晓佳，张孜，杨烨，温预关，2，尚德为，2

（1.广州医科大学附属脑科医院，广东广州 510370；
2.广东省精神疾病转化医学工程技术研究中心，广东广州 510000）

2018 年世界卫生组织报告指出，中国是酒精消费增长速度最快的国家，酒精消费增幅为76%[1]。2019 年对中国精神障碍患者的调查显示酒精依赖患者的终身患病率为1.3%[2]。短暂适量饮酒对身体健康没有造成明显威胁，但长期慢性饮酒容易引起记忆力衰退、运动功能受损、冠心病等，并诱发成瘾[3]。饮酒导致的一系列相关疾病，在严重损害身心健康的同时也给社会带来沉重负担。研究表明，酒精可以影响多种受体及相关神经递质的异常[4]。长期慢性饮酒会导致酒精依赖，甚至成瘾，对神经系统造成严重损伤。但其相关机制尚未完全明确，有研究发现，色氨酸作为生物体内多种神经活性物质的前体，在调节神经精神疾病中起重要作用，关于酒精暴露与色氨酸代谢的相关性被广泛研究[5]。代谢组学是一种用于定量分析小分子代谢物的高通量分析工具，可对生物样本如血液、尿液、组织等进行检测。因此，本研究从代谢组学出发，考察异常高酒精消耗中多种氨基酸代谢及神经递质的差异变化，为酒精依赖机制的研究提供参考。

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、乙酸胺和氨水均为高效液相色谱级，购自美国Thermo Fisher Scientfifc公司。LC30A超高效液相（日本Shimadzu 公司）；
QTRAP 4500 质谱仪（美国Thermo Fisher Scientfifc公司）；
5425高速离心机（德国Eppendorf公司）；
ZLS-1 真空离心浓缩仪（湖南赫西仪器装备有限公司）；
BT25S 电子分析天平（德国Sartorius 公司）；
BSA124S-CW 电子分析天平（德国Sartorius 公司）；
XW-80A 涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）。

1.2 实验动物

6～7 周龄雄性SD 大鼠20 只，SPF 级，体质量150～180 g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002。

1.3 高酒精消耗大鼠模型的建立

使用单瓶强迫饮酒模型（20%酒精溶液）诱导高酒精消耗大鼠8周[6]。诱导过程中，每天需测量剩余酒精的质量，并计算大鼠的酒精消耗水平。每周称大鼠体质量1 次。接着使用双瓶自愿饮酒模型（20%酒精）筛选酒精高消耗大鼠持续1周，流程为：大鼠可以自由选择酒精或者纯水溶液，为避免位置偏好，每次重新放置酒瓶和纯水溶液需要更换瓶子位置。每天称量剩余酒精和纯水质量，并计算大鼠的酒精消耗水平[酒精占比=酒精消耗量/（纯水消耗量+酒精消耗量）]。

由于在动物模型中，酒精成瘾并没有统一的评判标准，为了简化模型的评价方法，参考现有的研究模型的建立方法，在本研究中将大鼠日酒精消耗量作为评价模型的终点指标。高酒精消耗大鼠标准[7]：酒精诱导结束后，根据大鼠在筛选期内1 周的酒精消费水平，酒精占比≥45%且1 周内超过3 d 的被归为高酒精消耗大鼠。

1.4 样本提取及制备

在酒精诱导开始前及8 周后分别进行眼眶取血。采集大鼠眼眶血约1 mL 于含抗凝管中离心处理（2 000g，25 ℃，10 min），收集上清液至0.5 mL 离心管中，并储存于-80 ℃中进行后续处理。

大鼠样本血清处理：600 L冰甲醇（-80 ℃预冷）加到100 μL 血浆样本中，涡旋混匀15 s，置于-80 ℃孵化约1 h，然后离心10 min（14 000g，4 ℃）。取500 μL 上清液真空干燥浓缩2.5 h（35 ℃）。再加入100 μL 50%乙腈复溶，涡旋静置0.5 h。再次进行离心10 min（14 000g，4 ℃），最后取100 μL 上清移至进样瓶。

1.5 代谢组学检测方法

LC30A质谱用于多种氨基酸及神经递质。色谱柱：waters XBrige amide column（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；
流动相：（A）乙腈；
（B）5%乙腈/95%水（含20 mmol乙酸铵+20mmol/L氨水，pH=9）。进样量5 μL，流速：0.5 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.6 代谢组学分析

数据处理是使用MS 定量软件MultiQuantTM（AB SCIEX，美国）用于色谱峰的识别以及积分。StatTarget 是基于R 语言开发的组学统计分析工具，具有简单易用的界面，提供基于质控（QC）的组学数据校正和广泛全面的统计分析。校正后的数据用于结果的统计分析。

采用Metaboanalyst 平台进行代谢组学数据分析，数据经均值中心化及标度化处理。多元统计分析包括主成分分析法（PCA）以及偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）及正交偏最小二乘判别分析方法（OPLS-DA）进行置换检验，两组之间的代谢物相对水平的比较显示在热图层次聚类中。变量投影重要性（variable important on projection,VIP）值表示PLS-DA 中每个变量x变量对y变量的总体影响。VIP＞1 且校正后P＜0.05 的代谢物被认为组间差异具有统计学意义。将识别出的独特代谢物输入Metaboanalyst 平台，参考P＜0.05 及影响值（impact value,IV）＞0.1 以获得与酒精依赖相关的显著差异代谢途径。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25 软件进行数据分析。计量资料以表示，采用t检验或方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 检测结果数据评价

根据高酒精消耗模型筛选标准[7]，筛选出10 只高酒精消耗大鼠。实验选取第0 周（AA，对照组）和第8 周（FF，实验组）的大鼠血清作为自身对照进行代谢物差异分析。

QC 样本被用以评价分析数据的质量。本研究中所有代谢物的相对标准偏差（RSD）均小于30%，此外PCA 模型（图1）显示经过较正后的QC 样本具有较好的聚集性，证明代谢组学检测方法稳定重复性良好，数据质量可靠，数据满足于下一步的统计分析。

图1 校正后样本质控PCA图Figure 1 PCA diagram of sample quality control after correction

2.2 长期慢性高酒精消耗大鼠血浆差异氨基酸及神经递质筛选

通过考察代谢物信号校正后的RSD，最终对RSD小于15%的代谢物进行统计分析。PLS-DA 模型用于比较AA 组和FF 组之间的代谢物差异（图2A）。从OPLS-DA 的置换排列显示，对照组和实验组之间存在明显差异，其模型预测能力的指标值Q2为0.935（P＜0.01）和解释能力的指标值R2Y为0.995（P＜0.01），结果表明模型拟合准确性好。

VIP 反映了代谢物对模型的贡献。根据VIP＞1，鉴定出30 个潜在差异代谢物（图2B）。在长期慢性饮酒过程中13个差异代谢物显著上调，包括犬尿喹啉酸、色氨酸、血清素等；
其余的显著下调，包括谷氨酸、天冬氨酸等。另外绘制了Pearson相关的层次聚类热图分析显示差异代谢物之间的相关性，发现两组之间存在明显的代谢物差异（图2C）。

图2 实验组（FF）及对照组（AA）之间的差异代谢物Figure 2 Distinctive metabolites between the experimental group（FF）and the control group（AA）

2.3 差异代谢物通路富集分析

基于30 种潜在显著差异代谢物（表2），导入MetaboAnalyst 5.0数据库进行通路富集分析（pathway analysis），涉及的通路如表3 所示。根据P＜0.05 及影响值IV＞0.1 的通路，筛选出4 条差异显著的代谢途径，其中具有较高通路影响值的通路为色氨酸代谢（P=3.56×10-2，IV=0.299 55），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（P=1.28×10-2，IV=0.420 68）。

表2 校正后两组差异代谢物峰面积的比较Table 2 Comparison of peak areas of differential metabolites between the two groups after correction()

表2 校正后两组差异代谢物峰面积的比较Table 2 Comparison of peak areas of differential metabolites between the two groups after correction()

表3 基于观察到的代谢物差异显著的通路途径Table 3 Pathways with significant differences in metabolites observed

本研究发现，长期慢性高酒精消耗大鼠血清多种氨基酸及神经递质等存在显著差异。差异代谢物涉及多条代谢途径，其中色氨酸代谢涉及的3 条代谢途径（吲哚、犬尿氨酸、血清素）以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢变化较显著。

鉴于犬尿氨酸通路代谢物的神经保护和神经毒性失衡与神经精神疾病的发病机制有关，色氨酸代谢紊乱可能导致成瘾的发生。血清素、犬尿喹啉酸、吲哚-3-丙酸是色氨酸代谢途径的下游产物。色氨酸对谷氨酸受体具有拮抗作用，参与多种精神疾病的生物机制[8]。血清素属于中枢兴奋性递质，长期酒精暴露使体内血清素水平上调，导致机体持续处于亢奋状态。犬尿喹啉酸作为神经系统有效的保护因子，与多种神经系统疾病的发生存在潜在相关性[9]。有研究通过抑制酒精依赖大鼠的犬尿氨酸-3-单加氧酶的活性，提高犬尿喹啉酸的合成[10]。结合本研究结果，作为犬尿氨酸代谢途径下游产物之一的3-OH-邻氨基苯甲酸是显著下调的，推测在长期酒精暴露中大鼠可能通过抑制该酶的活性，引起犬尿喹啉酸水平上调，起到神经保护作用。本研究结果（图3A）显示，实验组动物血液中色氨酸和血清素上调，这也与朱秀清[11]研究得到的结论相似，表明在酒精依赖患者中色氨酸代谢可能依赖于色氨酸/血清素途径。同时，研究结果显示差异代谢物主要富集在色氨酸代谢途径上，提示色氨酸代谢可能参与长期慢性酒精消耗诱发的相关疾病机制。

图3 显著通路的差异代谢物变化：色氨酸代谢（A）以及谷氨酸、天冬氨酸和N-氨基甲酰基-L-天冬氨酸代谢（B）通路Figure 3 Differential metabolite changes in significant pathways: tryptophan metabolism (A) and alanine,aspartate and glutamate metabolism(B)pathways

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢在过去研究被认为是与酒精依赖相关的主要异常富集代谢途径。有研究报道，酒精使用障碍患者的多个代谢途径发生显著改变，其中包括谷氨酸代谢、色氨酸代谢和组氨酸代谢等[12]。值得注意的是，本研究结果中，慢性高酒精消耗大鼠谷氨酸水平是显著降低的（图3B）。谷氨酸神经传递系统异常涉及多种精神疾病的发病机制，对于酒精依赖患者，神经传递系统中的谷氨酸神经递质、相关转运体及代谢酶的异常可能参与酒精依赖的潜在机制。有研究发现，慢性酒精暴露会增加伏隔核细胞外谷氨酸水平[13]，推测原因之一是酒精下调了谷氨酸转运体的表达，突触间隙的谷氨酸清除率降低，导致谷氨酸水平升高。虽然大多数研究表明，在一段时间的酒精暴露后，基础谷氨酸神经递质出现上调[14-16]。然而，并非所有研究都观察到这种增加[17]。Moghaddam 等[18]研究指出，高剂量酒精暴露会抑制细胞外谷氨酸水平。在Mostofa 等[19]的研究中也得出了类似结论：高水平的酒精可以通过减弱海马体的谷氨酸受体表达来降低谷氨酸水平。在高剂量酒精的诱导下，潜在解释了在本研究中谷氨酸水平下调的部分原因。在γ-氨基丁酸（GABA）和N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA）受体是参与酒精依赖的两个主要受体，被认为是异常酒精消耗的重要目标[20-21]。结合本研究结果中，对于谷氨酸水平的下调，推测原因之一是在长期且高剂量酒精消耗时，GABA 对谷氨酸能神经传递的抑制作用占主导，从而抑制了谷氨酸的释放。另外，虽然有研究发现长期慢性酒精暴露小鼠在戒断时期细胞外谷氨酸水平是增加[22]，但考虑本研究大鼠血清样本采集时，大鼠仍处于持续的酒精消耗状态，故大鼠没有表现出明显戒断症状，这也可能是没有引起谷氨酸水平上调的另一原因。此外，在谷氨酸与谷氨酰胺代谢途径中，谷氨酰胺合成酶参与催化谷氨酸和铵离子合成谷氨酰胺，因此本研究还考察了谷氨酰胺的变化趋势。虽然谷氨酰胺水平在统计中没有表现出显著趋势，但根据其变化趋势，在长期慢性酒精消耗大鼠中谷氨酰胺水平是升高的，故谷氨酸的下调与该通路可能有潜在相关性[23，24]，但该通路在长期慢性高酒精消耗发挥的作用需要进一步验证。

同时，天冬氨酸也作为脑内的兴奋性神经递质之一，本研究中实验组大鼠血液中天冬氨酸水平是显著降低，与张绍辉等[25]在酒精依赖大鼠的结论相似。另外，Hinton 等[26]研究指出，天冬氨酸可以作为治疗酒精依赖疾病的潜在生物标记物。鉴于本研究检测的是血液样品，这两种兴奋性神经递质在脑组织内的变化水平尚未可知。

总的来说，本研究结果从外周血清水平证实了长期慢性高酒精消耗可以显著影响某些氨基酸代谢物及神经递质的水平，其显著的代谢物特征有利于阐明异常酒精消耗的潜在分子机制。从代谢通路分析来看，色氨酸代谢途径上代谢物的变化是显著的，提示色氨酸代谢与异常酒精消耗存在相关性。另外，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，组氨酸代谢，精氨酸生物合成均涉及谷氨酸与天冬氨酸，这两个指标可能是诱发异常酒精消耗的敏感指标[27]。由于分组间统计数据可能存在偏倚，未来的研究将集中在更多的亚组分析，以尽量减少混杂效应因素的影响。