基于网络药理学和分子对接探讨玉屏风散“异病同治”荨麻疹、过敏性哮喘的作用机制*

陈若曦，张益生，李焱，孙孝亚

1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；

2.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700；
3.河南中医药大学，河南 郑州 450046；

4.河南省中药资源与中药化学重点实验室，河南 郑州 450046

荨麻疹俗称“风疹块”，是由于皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而出现的一种局限性水肿反应，可在24小时内自行消退，但会反复发生[1]。约半数的慢性荨麻疹患者的症状持续2年，20%患者的症状持续10年[2]，为患者带来巨大痛苦。抗组胺药是荨麻疹的一线治疗药物，但心脏病患者、孕妇及哺乳期妇女需慎用。此外，嗜睡是抗组胺药的常见并发症，极大限制了抗组胺药在临床的广泛使用。哮喘是一种低气道的慢性异质性疾病，其特征是慢性炎症和气道反应过度，症状有咳嗽、喘息、呼吸困难和胸闷[3]。2010—2012年由中国哮喘联盟组织的支气管哮喘的流行病学和发病相关危险因素的流行病学调查(CARE研究)显示，中国大陆地区成人哮喘的患病率为1.24%，据估计我国大约有3 000万哮喘患者，而过敏性哮喘是其中一个重要的表型，占成人哮喘50%以上，在儿童哮喘中达80%以上[4]。

玉屏风散最早记载于《丹溪心法》，由黄芪、白术、防风三味药组成，有益气固表止汗，扶正祛邪之效，广泛使用于荨麻疹、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、汗出异常等疾病的治疗中。多项研究表明，玉屏风散治疗荨麻疹及过敏性哮喘具有平稳控制症状、减少病情复发、提高患者生活质量等特点[5-8]。荨麻疹和过敏性哮喘分别为皮肤科和呼吸科常见过敏性疾病，《医宗金鉴·外科心法》中记载荨麻疹“由汗出受风，或露卧乘凉，风邪多中表虚之人”。《素问·太阴阳明论》曰：“犯贼风虚邪者阳受之，阳受之则入六府，入六府则身热，上为喘呼。”荨麻疹和过敏性哮喘的发病都是由于表虚感受外袭风邪，均属于玉屏风散的主治范畴。中医认为“肺主皮毛”，其理论源自《黄帝内经》，《素问·五脏生成》云：“肺之合皮也，其荣毛也。”《素问·经脉别论》云：“肺朝百脉，输精于皮毛。”《金匮翼·咳嗽统论》云：“皮毛者肺之合，皮毛受邪，必内合于肺。”这些论述从中医角度揭示了肺系疾病和皮肤病之间存在生理与病理的关系。本文通过构建玉屏风散和荨麻疹、过敏性哮喘之间的药物-潜在靶点网络，分析玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘可能的机制，并通过分子对接进行验证，从分子层面解释玉屏风散对于荨麻疹和过敏性哮喘异病同治的机制。

1.1 药物活性成分及作用靶点的搜集通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com)检索玉屏风散组方中药黄芪、白术、防风的化学成分，设定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，筛选得到玉屏风散的生物活性成分。通过TCMSP数据库检索活性成分的靶点蛋白，使用Uniprot数据库(http：//www.uniprot.org/)对靶点进行标准化命名。

1.2 荨麻疹及过敏性哮喘疾病靶点的获取通过GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)和在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//omim.org)进行疾病靶点的检索，得到荨麻疹和过敏性哮喘相关全部靶点，并将两种疾病的靶点进行汇总取交集。

1.3 玉屏风散治疗荨麻疹及过敏性哮喘的潜在靶点的获取及蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建将玉屏风散靶点与疾病交集靶点导入R4.0.0软件绘制Venn图，从而得到药物与疾病靶点的交集，即为玉屏风散治疗荨麻疹及过敏性哮喘的潜在靶点。使用Cytoscape3.8.0绘制“药物-活性成分-潜在靶点-疾病”交互网络图。利用String数据库(http：//string-db.org)，物种设置为“Homo sapiens”，设置中等置信度“medium confidence=0.4”，得到蛋白相互作用PPI网络，并使用Cytoscape 3.9.0对PPI网络进行优化。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析利用R4.0.0软件，安装Bioconductor的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview程序包，以p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05为标准，对潜在靶点进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。

1.5 分子对接选择玉屏风散中度值排名靠前的活性成分与疾病的核心靶点进行分子对接验证。在PDB蛋白数据库(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)获取核心靶点蛋白结构；
在PubChem 数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取主要成分化合物结构。使用Autodock软件进行分子对接，并将对接结果使用PyMOL进行可视化处理。

2.1 玉屏风散主要活性成分及靶点在TCMSP数据库中共检索到黄芪活性成分87个，白术活性成分55个，防风活性成分173个。设置OB≥30%和 DL≥0.18进行筛选后获得主要活性成分共45个。利用TCMSP数据库检索到主要活性成分对应的作用靶点723个。在Uniprot数据库中获取到标准化命名的靶点共305个。

2.2 荨麻疹及过敏性哮喘疾病靶点在GeneCard数据库中检索到荨麻疹相关靶点976个，过敏性哮喘相关靶点7 507个。在OMIM数据库中检索到过敏性哮喘相关靶点35个，未检索到荨麻疹相关靶点。将疾病靶点去除重复值后取交集，得到交集靶点386个。

2.3 玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘的潜在靶点及“药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络取玉屏风散靶点及荨麻疹和过敏性哮喘共同靶点绘制Venn图，得到玉屏风散与荨麻疹和过敏性哮喘共同靶点的交集靶点24个，即为玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘的潜在靶点，见图1。使用Cytoscape 3.8.0软件绘制“药物-活性成分-潜在靶点-疾病”交互网络图，见图2，图中绿色节点代表玉屏风散主要活性成分，紫色节点代表潜在靶点，连线代表相互作用，连线越密集代表相互作用越强。图中与潜在靶点连线最为密集的活性成分为槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、汉黄芩素(wogonin)，由此可看出，玉屏风散中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素成分在方中起着关键作用，可能是玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘的核心成分。图中玉屏风散中部分活性成分可对应多个疾病靶点，而部分疾病靶点也可对应多个活性成分，提示玉屏风散治疗荨麻疹及过敏性哮喘具有多成分、多靶点的特点。

图1 玉屏风散活性成分靶点与荨麻疹、过敏性哮喘靶点交集Venn图

图2 “药物-活性成分-潜在靶点-疾病”交互网络图

2.4 PPI网络将24个潜在靶点导入String数据库构建PPI网络，该网络共有24个点，107条边，平均节点度值(average node degree)8.92。通过R计算出各靶点的degree值，排名前10位的靶点为白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3，CASP3)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF1A)、酪氨酸激酶受体2(epidermal growth factor receptor 2，ERBB2)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3，IGFBP3)、血管细胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)，提示这些靶点在玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘中具有重要意义。使用Cytoscape3.9.0软件设置节点的度值与节点的颜色深度成正比，颜色越深表明该节点在整个网络中发挥的作用越大，并将节点依据度值排列，优化后的PPI网络见图3。

图3 Cytoscape优化的PPI网络图

2.5 GO功能富集分析将PPI网络中的24个潜在靶点进行GO功能富集分析，以P<0.05，q<0.05 为标准，共获得81个统计学显著的结果，其中38个生物过程条目，43个分子功能条目，无细胞组分条目。将排名前20位的条目绘制成条形图，见图4，其中，生物过程有整合素结合(integrin binding)、谷胱甘肽结合(glutathione binding)、寡肽结合(oligopeptide binding)等；
分子功能有乙酰胆碱受体活性(acetylcholine receptor activity)、G蛋白耦联血清素受体活性(G protein-coupled serotonin receptor activity)、血清素受体活性(serotonin receptor activity)、G蛋白耦联神经递质受体活性(G protein-coupled neurotransmitter receptor activity)。提示玉屏风散通过调控多靶点、多种生物过程对荨麻疹和过敏性哮喘的治疗产生影响。

图4 GO功能富集分析

2.6 KEGG信号通路富集分析将PPI网络中的24个潜在靶点数据进行KEGG信号通路富集分析，以P<0.05，q<0.05为标准共获得93个统计学显著的结果，将排名前20位的通路绘制成气泡图，见图5，结果显示，玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘可通过多种信号通路、疾病通路及代谢通路发挥作用，包括癌症中蛋白聚糖通路、糖尿病并发症中的糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products，AGE-RAGE)信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt)信号通路等。

图5 KEGG信号通路富集分析结果

2.7 分子对接结果研究表明，黄芪中的主要成分黄芪甲苷可改善小鼠气道炎症、抑制气道高反应、缓解哮喘进展[9-10]；
防风中的升麻素具有显著的抗过敏作用及抗特应性皮炎作用[11-12]。在Pubchem数据库中未查询到升麻素的3D结构，故将黄芪甲苷和玉屏风散中连线数排名前3位的化学成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇与度值排名前3位的潜在靶点IL-6、VEGFA、EGFR进行分子对接，结果显示，玉屏风散主要成分与潜在核心靶点具有较强的结合能，见表1。使用PyMOL将对接结果进行可视化处理，其中黄芪甲苷与关键靶点的对接模式图见图6。

注：A：黄芪甲苷与IL-6；
B：黄芪甲苷与VEGFA；
C：黄芪甲苷与EGFR

表1 主要活性化合物与核心靶点分子对接结果 (kcal·mol-1)

荨麻疹的发病机制目前尚未明确，其同时具有自身免疫性和变态反应性疾病特征，核心环节是肥大细胞释放组胺和其他炎症因子，进一步导致皮肤血管扩张[13]。过敏性哮喘是支气管哮喘的一个重要表型，是一种由过敏原引起和触发的一类哮喘，主要由Th2免疫反应驱动，发病涉及特应质、过敏反应或变态反应[4]。在临床治疗荨麻疹和过敏性哮喘中联合使用玉屏风散可减少疾病复发，提高治愈率。网络药理学将中药作用网络与疾病生物网络整合在一起，分析药物在此网络中与特定节点的相互作用关系，从而理解药物和机体的相互作用，科学预测中药治疗疾病的有效机制[14]。

本研究通过挖掘玉屏风散与荨麻疹和过敏性哮喘的交集靶点发现，玉屏风散中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素等成分可对应多个疾病交集靶点。槲皮素、山柰酚、汉黄芩素均为黄酮类化合物，具有抗炎作用。研究证实，槲皮素可显著抑制白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)等炎症因子的生成从而发挥抗炎作用，且抗炎作用与剂量呈正相关关系[15-17]。山柰酚能够抑制脂多糖及ATP诱导的心肌成纤维细胞中PI3K和AKT蛋白的磷酸化，从而减轻炎症因子造成的损伤[18]，还可降低银屑病小鼠皮损中IL-17A、IL-6、TNF-α等促炎因子水平，从而减轻皮肤损伤及炎症[19]。汉黄芩素可通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt/ mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/m TOR)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和NF-κB信号通路而激活树突状细胞，并介导细胞因子TNF-α和IL-6的释放以产生免疫调节作用[20]，还可通过诱导中性粒细胞凋亡和抑制气道平滑肌细胞的迁移，从而改善中性粒细胞性哮喘气道炎症及重塑[21]。β-谷甾醇是植物中甾醇类成分之一，其生理活性丰富多样，包括通过下调 IL-1β、IL-6和TNF-α水平，改善炎症反应[22]。

“药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络和PPI网络分析显示，玉屏风散治疗荨麻疹及过敏性哮喘主要作用于IL-6、VEGFA、EGFR、CASP3、HIF1A等靶点。IL-6可刺激VEGF的释放，产生强烈的血管通透效应，加剧炎症的产生。已有研究证实，慢性荨麻疹患者血清中IL-6水平升高[23]。此外，IL-6也可引起异常的免疫应答，进而引发呼吸道变态反应性炎症，在呼吸道变态反应性疾病的免疫病因学中起重要作用[24]。VEGFA是VEGF成员之一，作为促血管生成因子在促进内皮细胞的存活、迁移、增殖以及增强血管通透性中发挥作用[25]。VEGF被认为是调节哮喘气道血管生长的主要因子[26]，而血管通透性升高、炎症介质释放是荨麻疹重要的病理过程，因此推测玉屏风散可通过调节炎症因子的释放、改善血管通透性进而改善过敏性哮喘及荨麻疹的症状。EGFR是一种表皮细胞保护因素，EGFR降低可导致IL-6等促炎因子释放引起炎症反应，介导角质细胞凋亡及组织损伤[27]。

GO富集分析共得到81个生物过程，结果显示玉屏风散主要是通过对乙酰胆碱受体活性、G蛋白耦联血清素受体活性、血清素受体活性、G蛋白耦联神经递质受体活性、整合素结合等的调控发挥对荨麻疹和过敏性哮喘的治疗作用。KEGG富集共得到93条信号通路，其中癌症中蛋白聚糖通路、PI3K-Akt信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、人类巨细胞病毒感染通路等是玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘的主要信号通路。PI3K-Akt信号通路是研究最完整的细胞信号通路之一，参与调控细胞的代谢、增殖、分化和凋亡等生物过程，并在肿瘤、自身免疫性疾病、纤维增生性疾病等中都存在异常表达[28]。PI3K-Akt可以激活NF-κB通路，诱导 IL-6等促炎因子、趋化因子、黏附分子及炎症级联反应相关酶的表达，进而趋化炎症细胞浸润，导致炎症反应的发生[29]。研究发现，PI3K-Akt信号通路可抑制氧化应激反应的过度激活，进而减轻细胞凋亡和血管损伤等，以促进创面的愈合[30]，还可广泛参与哮喘的炎症、变态反应、气道重塑等病理过程[31]。药理学研究也证实，槲皮素和汉黄芩素均具有抑制PI3K-Akt信号通路的作用[32-33]。GO和KEGG富集分析表明玉屏风散治疗荨麻疹和过敏性哮喘的机制多重且复杂，尚需进一步实验以明确各途径在疾病中的调控作用。

活性成分与核心靶点之间的结合能越低，表明两者之间有较好的结合力，普遍认为结合能小于0 kcal·mol-1时受体分子与配体分子可以自主结合，本研究中各主要成分与核心靶点之间的结合能均小于0 kcal·mol-1，结合位点均有稳定的氢键形成，其中IL-6与山柰酚、VEGFA与山柰酚、VEGFA与β-谷甾醇、CASP3与β-谷甾醇的结合能小于-5 kcal·mol-1，表明玉屏风散的主要活性成分能与荨麻疹和过敏性哮喘的核心靶点稳定结合，从而起到治疗疾病的作用。

综上所述，玉屏风散可通过相同的多个成分、靶点、通路治疗荨麻疹和过敏性哮喘，发挥异病同治作用，为后续中药的异病同治研究提供理论基础。但本文仅局限于网络药理学与分子对接的生物信息学研究，中药复方的量效关系及玉屏风散的作用机制仍需进一步实验验证。下一步研究拟以荨麻疹及过敏性哮喘小鼠模型为研究对象，并采用玉屏风散进行干预，通过检测荨麻疹小鼠腹腔肥大细胞及过敏性哮喘小鼠气道分泌物中IL-6、VEGFA、EGRF等因子的变化，进一步验证玉屏风散对于荨麻疹及过敏性哮喘“异病同治”的作用机制。