突变EGFR,PROTAC降解剂的设计与合成及活性研究

刘婷梅，杨 瑜，王 欣，李文镇，张义文

四川大学华西医院 肿瘤中心（成都 610041）

近年来，癌症的死亡率逐年上升，肺癌所占的比例更是居高不下[1-4]。其中，非小细胞肺癌是一种与表皮生长因子受体基因（EGFR）密切相关的典型恶性肿瘤，严重危害着人类的健康[5-6]。EGFR是一种受体酪氨酸激酶（RTK）[7]，由氨基末端胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域组成[8-9]，在多种肿瘤组织中表达，并通过与表皮生长因子等配体的结合来抑制肿瘤细胞凋亡。EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的出现为肺癌病人带来了曙光，可是一代又一代的上市药物在治疗一段时间后都出现了耐药性[10-12]。

癌细胞可以辅助其它现有的RTK 信号通路，使受抑制的RTK继续作为一个节点存在从而恢复下游的致癌信号，因此直接把RTK 降解而不是对激酶活性的抑制，可能是一种会产生更持久、完整的下游信号失活的策略[13]，同时也直接避免了基因突变导致的耐药。近几年，PROTAC 凭借其可降解“不可成药”的靶点而备受关注。其利用双功能化合物与靶蛋白和E3 泛素连接酶形成三元复合物[14-15]，能将靶蛋白泛素化标记并降解，理论上能完美的避开基因突变而导致的耐药性问题，并且还具备适用范围广、选择性高、剂量小和毒副作用小等优点，是靶向治疗领域中一个很有前景的方向[16-18]。本研究选择了目前处于临床I 期的对EGFR19del以及EGFRL858R均有效的药物AZD-3759 作为靶蛋白配体[18]，E3泛素连接酶则选择了VHL这个已被报道适用于PROTAC 的配体，设计合成了7 个化合物，并评价了其活性。

1.1 实验试剂

CCK8（Sigma），E746-A750del抗体（CST），周期检测试剂盒（BD Phamingen RPMI），PIPA 裂解液（上海雅酶生物科技有限公司），BSA（Solarbio），超敏化学发光液（CST）；
其他试剂均为市场售分析纯。

1.2 主要仪器

Bruker-AMX 400 核磁共振仪（德国布洛克公司），Agilent ESI-TOF 高分辨质谱仪（美国麦克柔曼斯公司），琼脂糖凝胶电泳仪（君意），酶标仪（Bio-Rad），流式细胞仪（艾森），高速离心机（Eppendorf），化学发光仪（上海勤翔）。

1.3 化合物合成

以对EGFR19del和EGFRL858R均有效的药物AZD-3759 作为靶蛋白配体进行修饰，选择靠近溶剂侧的哌嗪环的氮连接linker，E3 泛素连接酶配体选择VHL；
linker主要是不同长度的PEG链或不同长度的直碳链，设计合成7个化合物，具体合成路线见图1、图2。

图1 VHL的合成试剂和条件Figure 1 Synthetic reagents and conditions for VHL

图2 EGFR19del突变型PROTAC化合物的合成试剂及条件Figure 2 Reagents and conditions for the synthesis of EGFR19del mutant PROTAC compounds

1.4 药理实验方法

1.4.1 CCK8 抗肿瘤细胞增殖实验 将对数生长的细胞接种到96孔板，每孔约3 000个，37 ℃恒温培养24 h。将待测化合物按一定浓度梯度分别加入96孔板，每个浓度3 个复孔，设置3 个DMSO 对照组以及3 个只接种细胞的完全空白对照。在化合物对细胞作用96 h后每孔加入15 μL CCK-8 试剂，孵箱内避光1.25 h 后测定450 nm 下的OD值。最后用GraphPad Prism8 拟合IC50值[19]。

1.4.2 Western blot蛋白降解实验

1.4.2.1 蛋白样品的制备 细胞接种于6 孔板，每孔约50万细胞，培养24 h待细胞贴壁。弃去原培养基，将其换为无血清培养基8 h 后加入相应化合物。作用24 h后拿出培养板，先将带细胞的培养基吸到BD 管，各加入500 μL胰酶，放入孵箱10 min，离心（3 000 r，3 min），离心后倒掉液体，加入1 mL PBS，并将离心成团的细胞轻轻吹起，转移到EP 管再离心，进行两次。洗涤后的细胞加入裂解液和1%蛋白酶抑制剂（300+3 μL），裂解5 min吹打细胞，到10 min结束，然后4 ℃离心（15 000 r，10 min）。蛋白定量。取40 μL 蛋白上清，加入10 μL SDS-PAGE 上样缓冲液，煮沸10 min，放-20 ℃备用。根据得到的蛋白浓度及10 μg 上样量计算所需上样体积。

1.4.2.2 SDS-PAGE 凝胶电泳和转膜 将电泳后的胶取出，根据目标条带和内参位置切下所需要的部分，小心转移到铺好4 层滤纸的负极三明治模具上，赶走气泡。剪下PVDF 膜做好标记，用甲醇浸泡15 s，然后放至转移缓冲液中平衡然后放到胶上，赶走气泡，再铺上4 层滤纸。装配好转膜三明治放进电泳槽，转膜电压设置为100 V，内参和目的蛋白分别转1 h 和2 h。然后在5 %脱脂牛奶的TBST 缓冲液中室温封闭1 h。

1.4.2.3 免疫杂交染色 用TBST 洗涤封闭好的PVDF膜3次，每次约5 min。加入一抗并用杂交膜封闭，4 ℃震荡孵育过夜后用TBST 洗涤封闭好的PVDF 膜3 次，每次10 min。按说明书配置二抗，杂交袋中室温孵育30 min再转到37 ℃震荡30 min，继续用TBST洗涤3次，TBS洗涤1次。最后配置显影液，显影曝光拍照[20-21]。

1.4.3 流式实验探究PROTAC分子抗增殖机理 细胞处理：培养PC-9细胞，细胞用胰酶消化10 min，终止消化，离心重悬计数，铺到6 孔板。用不同浓度化合物（0、0.01、0.1、0.5、1 μM）处理细胞。检测：将化合物作用32 h后的细胞离心，PBS洗涤，加入预冷的70%乙醇4°C过夜。将周期检测试剂盒中的RnaseA 和PI按1:9配置，现配现用细胞离心并用PBS洗涤，加入500 μL配置好的染液，上机检测[22]。

2.1 目标化合物的制备

通过上述反应路线，制备了7个目标化合物，分别是AZDV-P1、AZDV-P2、AZDV-P3、AZDV-5、AZDV-7、AZDV-9 和AZDV-10，目标化合物均用核磁和质谱等波谱手段进行表征。

2.2 化合物对肿瘤细胞的抗增殖活性

用CCK-8检测目标化合物对PC-9、H1975和A549等3 种肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50），AZD-3759 作为阳性对照，实验结果如表1所示。

表1 AZDV系列化合物对不同肿瘤细胞的抗增殖活性（n=3，IC50±SD）Table 1 Antiproliferative activity of AZDV series compounds on different tumor cells（n=3，IC50±SD）

2.3 化合物引起蛋白降解

为了探究上述抗增殖活性较好的3 个PROTAC 化合物（AZDV-P1、AZDV-9 和AZDV-10）以及阳性对照化合物是否有引起EGFR蛋白降解的效果，从8～5 000 nM 设置了6 个浓度，用Western Blot 对其进行验证，实验结果如图3A 所示。为了确认PROTAC 化合物是否表现出“勾效应”，对效果较好的两个化合物（AZDV-P1和AZDV-10）从0.01～5 000 nM 设计了9 个浓度，实验结果如图3B所示。

图3 不同浓度化合物处理后EGFR19del蛋白的表达情况Figure 3 Expression of EGFR19del protein after treatment with different concentrations of compounds

2.4 化合物作用机理探究

为了探究化合物发挥作用机理并结合前人所做研究中PROTAC 化合物的作用机理，用细胞流式仪进行了化合物AZDV-9和AZDV-P1阻滞细胞周期的探究，实验结果如图4、图5所示。

图4 AZDV-9对细胞周期的影响Figure 4 Effects of AZDV-9 on the cell cycle

图5 AZDV-P1对细胞周期的影响Figure 5 Effects of AZDV-P1 on the cell cycle

从表1 可以看出，AZDV 系列化合物对PC-9 细胞（EGFR19del）的IC50值均小于1 μM，其中AZDV-9 和AZDV-P1的IC50值在10 nM左右，AZDV-10为81.1 nM，均高于AZD-3759 的IC50值（5.6 nM）。为进一步了解AZDV系列化合物的选择性，检测了其对双突变细胞系H1975（EGFRT790M/L858R）以及野生型A549（EGFRwt）的抑制效果，发现效果远不如PC-9 细胞，10 μM 以内仅个别化合物抑制率达到50%，也说明该系列化合物选择性较好。

从图3A可以看出化合物AZD-3759和AZDV-9几乎没有降解效果，而化合物AZDV-P1 和AZDV-10 均能导致靶蛋白降解，但是在低浓度下降解效果较好，增加浓度效果反而减弱。对于两个没有蛋白降解的化合物，AZD-3759 不是PROTAC 化合物，本身是通过与ATP竞争结合EGFR阻断下游通路发挥作用，所以不会引起蛋白降解；
对于AZDV-9推测它的IC50较低主要是抑制剂本身发挥作用（而不是PROTAC 效应的结果）。AZDV-P1和AZDV-10均能引起蛋白降解，且能观测到勾效应。总之，通过蛋白降解实验对PROTAC 化合物进行验证，表明AZDV-P1 和AZDV-10 均能引起蛋白降解，并且观测到了勾效应。

从图4、图5 可以看出，AZDV-P1 有效且也能观测到勾效应，能将周期阻滞在G1 期。AZDV-9 效果不太明显，这方面跟WB 结果比较吻合，说明AZDV-9 发挥作用的方式可能不是PROTAC效应。

19 号外显子突变中最常见的就是746～750 位密码子缺失，约占EGFR总的突变类型的40%～50%[23]，并且作为一线治疗首选的上市一代和二代药对19 号外显子突变病人效果显著，美中不足的是很快就发生耐药性[24-25]。本研究设计并合成一系列靶向EGFR的PROTAC 化合物，对化合物的抗肿瘤活性和机制进行了探究，结果显示AZDV-P1 和AZDV-10 均能引起蛋白降解，并观测到了勾效应。这一研究结果或能为克服EGFR耐药提供一个新的方向。

（利益冲突无）