湘西地区核桃坚果表型特征及多样性研究

李建挥，李柏海 *，吴思政，柏文富，禹 霖，聂东伶，严佳文，熊 颖，向祖恒，彭先凤

(1.湖南省植物园，湖南 长沙 410116；
2.龙山县林业局，湖南 龙山 416800)

核桃(Juglansregia)和泡核桃(J.sigillata)是胡桃科核桃属中广泛栽培的干果和油料树种。我国是核桃生产大国，核桃产量占世界总产量的一半以上，有20个省(区、市)的1 000多个县栽培核桃，主要产区为云南、新疆、陕西、四川、山西、河北、北京、天津、辽宁、山东等地。核桃种质资源是核桃产业可持续发展的基础和保障，其主要包括核桃的栽培种、野生资源以及利用二者再创造的遗传材料。我国最早培育的辽宁系列、中林系列、‘香玲’等核桃良种，就是以新疆早实核桃为亲本与当地实生农家类型杂交选育而来。近年来，随着核桃产业的不断发展，实生农家类型和自然群体不断流失和破坏，各地纷纷开展了核桃种质资源调查、收集和评价研究，以期摸清核桃种质资源的多样性，为科学保护和开发利用提供依据[1-2]。

以表型性状来检测植物变异是一种直观便捷的方法，能在一定程度上揭示物种遗传多样性[3]。核桃坚果表型特征是其表型性状的直观体现，直接反映区域内核桃资源的多样性[4-5]。湖南省是核桃的天然分布区，核桃栽培有上百年的历史[6]。该地区长期采用实生播种繁殖，树体常为半野生状态，使得核桃资源积累了较丰富的变异，形成了一定数量的实生类型群体，是核桃开发利用的宝贵材料。20世纪80年代末，何方等[6]对湖南省的核桃资源进行了调查研究，初步摸清了湖南省核桃资源、优良类型以及栽培历史与现状。之后，吕芳德团队在湘西地区开展了核桃资源调查、经济性状测定以及坚果品质分析，选育出了一批优良单株[7-8]。王容等[9]比较了湘西北地区13个核桃样品的坚果综合品质，但由于采集的资源数量有限，鲜少涉及坚果表型特征研究，未能展现出该地区核桃资源的多样性情况。本研究在湖南省核桃遗传资源调查的基础上，以湘西地区的223份种质资源为试材，测定了坚果表型的质量性状和数量性状，分析了该地区核桃资源的多样性状况，以期为湖南省开发利用核桃种质资源提供理论参考。

1.1 研究区概况

湖南省西部是依据武陵山脉、雪峰山脉和云贵高原东侧，沅水、澧水中上游及其支流汇聚的地理形势自然形成的广大地区(108°47′～112°10′E，26°38′～30°08′N)，常被统称为湘西地区、湘西或大湘西，主要包括张家界市、湘西土家族苗族自治州、怀化市、邵阳市、常德市等[10-12]。该地区属中亚热带季风湿润气候，气候温暖，降水充沛，光热偏少，年均气温16～17 ℃，年降水量1 300～1 390 mm，年日照1 563.3 h[7]，地貌以山地、丘陵为主，土壤以红壤、黄壤、石灰土为主，是核桃的自然分布区和适宜种植区[13]。

1.2 试材采集及性状测定

在核桃和泡核桃资源分布集中区域，由当地林业部门工作人员做向导，实地走访当地群众，确定调查的核桃单株，记录核桃树体信息。9月中旬，核桃成熟时，每个单株收集50个核桃果实带回实验室，待核桃自然风干，测定坚果表型性状。

坚果质量性状参照GB/T 26909—2011《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南：核桃属》[14]进行特征描述和赋值，测试指南中未描述的特征用“其他”表示，共选择13个质量性状。坚果数量性状有8个，其中的单果质量与核仁质量用电子天平测量(精确度0.01 g)，出仁率=核仁质量/单果质量×100%；
坚果大小用游标卡尺(精确度0.01 mm)测量，核壳厚度在切开坚果后，用游标卡尺测量其胴部位置(精确度0.01 mm)。坚果果形指数=(侧径+横径)/2倍纵径，三径均值=(纵径+侧径+横径)/3。

1.3 数据处理

供试的223份核桃样品来自湘西地区的4个县、15个乡镇，采样地信息和样本数见表1，坚果表型特征赋值描述见表2。

表1 采样地基本信息及样本数Table 1 The ecological and geographical information and sample size of populations

表2 核桃和泡核桃坚果表型特征赋值及描述Table 2 The description and assignment of nut quality character for walnut accessions

运用Excel 2007计算表型性状的平均值、标准差、变异系数和分布频率等，绘制数量性状频率数据分布直方图。进一步计算Simpson 指数、Shannon-Wiener 指数[15]、群体间和群体内方差分量及表型分化系数[16]等。用SPSS 19.0进行群体间坚果表型性状变异系数多重比较，根据表型性状平均值，采用组间连接法计算群体间的欧氏距离并进行聚类分析。采用GenAlEx 6.5对群体间欧氏距离与地理距离进行Mantel 检验[17]评估其相关性。

2.1 坚果表型性状的多样性分析

2.1.1 质量性状的变异及分布

核桃表型质量性状频率分布及多样性指数见表3，可以看出：核桃坚果表型质量性状的变异系数为18.71%～79.21%，Simpson指数为0.171～0.823，Shannon-Wiener指数为0.450～2.760，说明湘西核桃质量性状的多样性较丰富。沿缝合线纵切面形状圆形较多(30.94%)，心形最少(1.35%)，除核桃属DUS测试指南规定的8种外，还出现了三角形、扁圆形、倒卵形3种其他类型(2.24%)；
垂直缝合线纵切面形状(种形)以圆形较多(30.04%)，其次是扁圆形(23.77%)和方(梯)形(20.18%)，心形(0.90%)和长椭圆形(0.90%)最少，出现了倒心形、阔纺锤形、“苹果型”3种其他类型(8.52%)。坚果横切面形状大多为扁圆形(84.30)，未发现有内凹扁圆形和椭圆形，但出现了1种其他类型(长方形，0.45%)。顶尖突出程度以尖最多(58.30%)，果肩形状以平为主(37.67%)，果底形状以稍凸为主(43.05%)，核壳表面多为刻窝少(42.60%)、刻纹浅(59.64%)的类型。缝合线以2条居多，占比达89.24%，2～3条和2～4条的资源分别占比6.73%和3.59%,3条的仅出现1份资源，占0.45%，未出现3～4条和4条的资源。缝合线绝大多数为凸起(90.58%)，缝合线平的有9.42%，未见缝合线凹的资源。横膈膜质地和内褶壁质地均以革质占多数，分别为65.47%和52.91%。横膈膜骨质占比为23.77%,内褶壁骨质占比26.01%，说明湘西地区存在较多核桃的原始类型。横膈膜膜质和纸质的占比合计10.77%，内褶壁退化的为21.08%，未见内褶壁膜质资源。核仁皮色多为浅褐(39.46%)，其次为黄(26.46%)、浅黄(13.90%)、褐(13.45%)、黄白(5.83%)、紫褐(0.45%)、浅蓝(0.45%)。

表3 核桃表型质量性状频率分布及多样性指数Table 3 The distributive frequency and diversity index for phenotypic quality traits of walnut

2.1.2 数量性状的变异及分布

坚果表型数量性状的变异情况见表4。由表4可见，以单果质量的变异系数最大，为27.49%；
其次为壳厚，变异系数为26.48%；
果形性状的变异系数较小，变异范围在8.37%～11.17%。单果质量为5.28～31.70 g，平均13.07 g；
壳厚为0.56～2.91 mm，平均1.51 mm；
出仁率为29.60%～67.32%，平均37.32%；
三径均值为23.58～40.97 mm，平均30.98 mm；
果形指数为0.74～1.25，平均0.97。各个坚果表型数量性状分布直方图及其偏度系数(Skewness)和峰度系数(Kurtosis)见图2，表明8个数量性状均符合近似正态分布。单果质量以10～14 g居多，占比为49.33%；
出仁率多在46%～55%之间，占比为48.88%；
壳厚1.0～1.6 mm的比例达到56.95%，说明湘西地区薄壳核桃占比较大，1.6 mm以上的中厚壳资源占比34.98%，1 mm以下的纸皮核桃占比较少，为8.07%；
三径均值集中在30～34 mm，占比达50.22%；
果形指数0.97～1.07的占比42.15%。

表4 核桃表型数量性状的变异情况Table 4 The variations of phenotypic quantitative traits of walnut

图1 核桃表型数量性状分布Fig.1 The distribution of phenotypic quantitative traits for walnut

2.2 坚果表型的变异和分化情况

21个供试坚果表型性状在15个群体间的平均变异系数为7.47%～78.24%，平均为26.47%，各个表型性状的变异系数间有显著性差异(P<0.05)(表5)，其中变异程度最大的为种形，变异系数为78.27%，说明此性状变异最丰富。变异程度较小的为坚果大小和果形相关性状，变异系数范围为7.47%～10.39%。群体内21个性状变异系数的平均值为20.31%～31.54%，群体间差异不显著(P>0.05)。

表5(续)

对核桃坚果表型性状的方差分量进行进一步分析表明(表6)：21个坚果表型性状在群体间和群体内平均方差分量百分比为64.03%和35.97%，说明湘西地区核桃群体间变异大于群体内的变异。其中，果底形状、刻纹、缝合线突出程度、横膈膜质地、内褶壁等5个质量性状的群体间方差分量显著大于群体内方差分量。数量性状除侧径外，其他性状的群体间方差分量均显著大于群体内方差分量。坚果性状的表型分化系数为40.44%～76.15%，平均为64.03%，表型分化系数最大的是纵径，最小的是种形。

表6 核桃坚果表型性状的方差分量和表型分化系数Table 6 The variance component and phenotype differentiation coefficient of nut phenotypic traits of walnut

2.3 坚果表型性状聚类分析

表型性状数据经Z-得分转化后，采用组间连接欧氏距离法，对223份核桃种质资源的21个坚果表型性状平均值进行系统聚类分析，结果显示，在欧氏距离15处，可以将15个群体划分为4个类群(图2)。

图2 核桃表型性状聚类树状图Fig.2 Cluster tree diagram based on phenotypic traits of walnut

龙山县各个乡镇和泸溪县白羊溪(BYX)资源聚为一大类，渠阳(QY)、新关(XG)以及壶瓶山(HPS)均单独为一类。其中，第1大类资源在欧氏距离10处进一步分为4个亚类，农车(NC)、洛塔(LT)、召市(ZS)、靛房(DF)、洗车(XC)、茨岩(CY)、茅坪(MP)聚为一类，包含154份样品，来源于龙山县中东大部分地区，占采集样品的69.06%；
石牌(SP)、洗洛(XL)聚为一类，包括22份样品，来源于龙山县西北地区；
红岩溪(HYX)聚为一类，含5个样品，来源于龙山县中部；
咱果(ZG)和BYX聚为一类，含14样品，来源于龙山县西南部及泸溪县白羊溪乡，且表型遗传距离(欧氏距离)与地理距离呈现正相关的趋势(图3)。

图3 群体间欧氏距离与地理距离的相关关系Fig.3 Geographic distance and Euclidean distance relationship

2.4 坚果表型遗传距离与地理距离的相关性分析

种群的地理距离和遗传距离相关性常用Mantel检验评估，当P<0.05时，认为地理距离和遗传距离具有显著相关性[18]。用SPSS相关性分析计算出群体间的欧氏距离，群体间地理距离为采样点间的直线距离。Mantel检验结果(图3)表明，群体间的欧氏距离与地理距离存在显著正相关性(R=0.502，P=0.023)。

表型多样性是了解遗传变异的重要线索，也是生物多样性的重要内容[19]，植物资源的开发利用往往离不开对表型性状的测定和分析[20-23]。本研究首次对湘西地区的223份核桃资源的21个坚果表型性状开展研究，结果表明该区域核桃坚果表型多样性丰富，其坚果质量性状的变异系数为18.71%～79.21%，Simpson指数为0.171～0.823，Shannon-Wiener指数为0.450～2.760，数量性状的变异系数8.37%～27.49%。除内凹扁圆形与椭圆形的坚果横切面形状，3～4条与4条的缝合线条数、凹缝合线以及膜质内褶壁，核桃属DUS测试指南中绝大多数坚果表型性状均有出现。此外，还发现了3种种形、3种沿缝合线纵切面形状、1种横切面形状和1种新的核仁皮色。

湘西地区核桃坚果表型特异性明显。核桃种形以圆形、扁圆形以及方(梯)形为主，和昭通市[4]、大理州[24]、怒江州[25]、凉山州[5]以及青海[26]等地相比，主要种形和比例均不相同，且方(梯)形占比达20.18%，远多于上述区域的1.00%～13.94%。横膈膜骨质和内褶壁骨质占比均超过20%，远高于其他区域的2.55%～11.21%和 3.18%～14.29%[4-5,24-25,27]；
1.6 mm以上的中厚壳资源占比34.98%，说明湘西地区厚壳核桃占比较大，剥壳取仁较难，存在较多核桃的原始类型。核仁皮色多为浅褐或黄色，占65.92%，特异性核仁皮色比例很低，仅出现浅蓝色和紫褐色资源各一份，未见乌仁、紫(浅紫)仁资源。核桃缝合线条数特征和其他地区大同小异，大多数为2条，2条以上的资源不多见。缝合线平的资源在该地区比较少见，不到10%，稍高于大理州、怒江州的4%左右[24-25]，与昭通市的14.10%[4]比较接近，低于凉山州的26.97%[5]，远低于甘肃的40.95%[27]和新疆的55.20%[28]。从这点看，该地区核桃表型介于西南地区的深纹核桃和西北地区的核桃之间,而且更倾向于深纹核桃。另据文献报道，我国16个早实核桃品种的单果质量为9.40～16.40 g[29]，大巴山区的为4.11～22.87 g[2]，西藏的为6.87～19.97 g[30]，云南的为3.48～31.80 g[4,24-25]，四川凉山州的为3.29～27.56 g[5]，伊朗的为 6.0～15.2 g[31]，印度的为4.85～20.55 g[32-33]，巴尔干半岛西部的为2.9～32.1 g[34]。湘西地区单果质量为5.28～31.70 g，和上述区域相比，变异范围非常大，其中中果型占比近50%，小于7 g的小果资源和大于22 g的大果资源各有4份。这些特异性的种质资源，为品种选育和生产需求提供了丰富的材料。

刘娟等[35]认为，变异系数在10%以上，表型性状变异分化比较明显。本区域坚果表型性状变异系数大都在10%以上，说明该地区表型性状的分化明显。表型分化系数平均为64.03%，群体间的表型分化大于群体内的表型分化，说明变异主要来源于群体间。可能是该区域核桃长期在一定范围内种植，商品化程度较低，人为传播较少，从而造成了群体间的分化。聚类结果显示龙山县各个乡镇和BYX聚为一大类，QY、XG以及HPS均单独聚为一类。壶瓶山是湘鄂两省分界山，地理环境和自然环境和新关镇有着很大区别，故而虽同处一县，但HPS和XG各自单独聚为一类，其遗传距离与其他群体最远。第一大类资源又可进一步分为4个亚类：龙山县中东大部分地区、中部的HYX、西北部的SP与XL、西南部ZG与泸溪县BYX，群体间的欧式距离与地理距离存在显著正相关性。由于表型易受环境的影响，加上本研究采样未能涵盖湘西大多数区域，考察的表型性状有限，仅反映出湘西地区核桃资源多样性的一部分内容。今后可继续采集资源，补充完善，以更加系统、全面地反映区域内核桃资源多样性，为核桃资源的有效开发利用提供更多详实的数据参考。