酶促反应结合灰度分析技术快速测定烟草及其制品中葡萄糖的含量

彭丽娟 ,何声宝 ,刘宇晨 ,袁 源 ,卢 钒 ,李 苓 ,王春琼,张 威*

(1.云南省烟草质量监督检测站,昆明 650106;2.国家烟草质量监督检验中心,郑州 450001;3.中国农业科学院烟草研究所,青岛 266000;4.武汉大学,武汉 430072)

烟草中的水溶性还原糖以葡萄糖和果糖为主,还有少量的蔗糖和麦芽糖。在卷烟燃烧过程中,水溶性还原糖可以与碱性燃烧物质发生中和反应,进而协调烟气的酸碱平衡,减少气味刺激性。当燃烧温度超过300 ℃时,这些糖类物质热解生成的呋喃衍生物、酮类以及醛类等羰基化合物与卷烟中的氨基化合物发生美拉德反应,产生烤烟特有的香气,进而改善抽吸口感[1]。目前,我国烟草行业测定烟叶中水溶性还原糖和总糖的方法主要有芒森·沃克法[2]和连续流动分析法[3],但是这两种方法都无法测定单糖组分的含量。文献[4]研究了烟草成分中的葡萄糖对烟气的影响,结果表明葡萄糖是良好的香味成分载体,其酯化和苷化反应能够丰富卷烟香气,提高烟气的圆润性;文献[5]研究了烟叶中果糖含量对评吸质量的影响,结果表明果糖含量增加有利于提高烟叶的绵延性和甜度,减少杂气。显然,不同种类的糖在卷烟燃烧过程中具有不同的吃味影响。因此,准确测定烟草及其制品中的水溶性还原糖,尤其是含量较多的葡萄糖和果糖,具有很重要的意义。

目前,报道过的单糖检测方法主要有近红外光谱法(NIR)[6]和离子色谱-脉冲安培检测法(ICPAD)[7-10]。NIR 利用不同单糖的羟基基团在近红外波段的吸收谱图的细微变化来实现定性和定量分析,具有快捷、无损、无污染、前处理简单等优点,但是样品中的水分会产生干扰,且仪器设备成本较高,需要较多的样品数据库建立预测模型。IC-PAD 基于糖类物质在碱性条件下具有阴离子化的特性,联用脉冲安培检测器检测被分离的羟基在电极表面发生氧化还原反应所产生的电流来确定单糖含量,具有灵敏度高、分析快速、干扰较小等优点,但仪器设备成本较高。此外,还有高效液相色谱法[11-15]和衍生化-气相色谱法[16]等也被用于单糖含量的测定。然而,这些方法都存在前处理步骤复杂、灵敏度低、检测成本高等缺点。因此,开发简单、快速的单糖分析方法仍然是本行业所需解决的关键问题。

基于酶联免疫法检测葡萄糖在医疗领域已得到广泛应用[17],其检测原理是利用葡萄糖氧化酶特异性氧化葡萄糖产生H2O2,然后利用类过氧化物酶催化H2O2氧化显色底物产生可见的颜色,通过检测颜色信号变化从而对葡萄糖进行定量。该方法具有灵敏度高、专一性强、效率快等优点,但是该方法需要专门的检测仪器,操作不便。近年来,随着智能手机的普及和图像处理技术的发展,用智能手机和图像转化软件进行定量的灰度法逐渐受到各领域研究者的关注[18-20]。该方法简单、快捷、精确度高且不需要专门的仪器辅助,逐渐被用于替代基于显色法的光度分析技术。基于酶促反应处理后,显色液的颜色深浅会随着产物含量的不同发生变化,结合灰度法,可以实现烟草及其制品中葡萄糖含量的简单、快速、准确的测定。

因此,本工作首先利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶将葡萄糖转化为醌类化合物,经过37℃水浴显色后,将含有不同浓度葡萄糖的显色液通过Image软件转化为灰度值,以水为参比,建立灰度值比值和葡萄糖浓度的对数之间的线性关系,并通过优化样品萃取剂和反应时间,实现烟草及其制品中葡萄糖含量的快速分析,以期为烟草行业检测葡萄糖含量提供一种有效、便捷的分析方法。

1.1 仪器与试剂

HP4896型紫外可见分光光度计;Waters e2695型高效液相色谱仪;5810R 型离心机。

葡萄糖标准储备溶液:50.0 mmol·L-1,称取9.008 gD-(＋)-葡萄糖标准品,用水溶解,并定容至1 L,得到50.0 mmol·L-1葡萄糖标准储备溶液。

葡萄糖标准溶液系列:移取适量的葡萄糖标准储备溶液于10 mL 容量瓶中,用水定容,配制成浓度 为0.100,0.500,1.000,1.500,2.000,2.500,3.000,3.500,4.000 mmol·L-1的葡萄糖标准溶液系列。

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒:R1 为1.06 g·L-1苯酚;R2为含0.102 g·L-14-氨基安替比林、1 k U·L-1过氧化物酶和36 k U·L-1葡萄糖氧化酶的混合溶液(pH 7.0)。

D-(＋)-葡萄糖、甘露糖、木糖、一水合鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖标准品的纯度均不小于99%,葡萄糖醛酸标准品的纯度不小于98%,一水合半乳糖醛酸标准品的纯度不小于97%;试验用水为纯水。

样品A、B、C、D 为2017年云南省烟草质量监督检测站制备的全国烟草系统中连续流动分析测试用标准烤烟样品。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

移取100μL 葡萄糖标准溶液系列于装有R1和R2试剂各450μL的2 mL 微量离心管中,混匀后置于(37±0.5)℃的恒温水浴摇床中反应5 min,得到显色液。利用智能手机对显色液拍照,然后用Image软件将彩色图片转化为灰度模式,得到灰度值。以水为参比,对显色液灰度值进行归一化处理,得到灰度值比值。以葡萄糖浓度的对数为横坐标,灰度值比值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 样品前处理

参考YC/T 31-1996《烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法》,将样品置于烘箱中,于(40±1)℃干燥24 h。取出,用粉碎机研磨,再依次用孔径为0.425 mm(40目)和0.250 mm(60目)的筛网筛分,将中间截留颗粒物置于密封袋中,常温下平衡48 h 后测定其中水分的含量。称取(0.1±0.000 1)g上述样品于50 mL 具塞三角瓶中,加入20 mL水后盖上塞子,在(30±0.5)℃的恒温水浴振荡器上以200 r·min-1转速振荡萃取30 min。萃取结束后,用快速定性滤纸过滤,弃去初始滤液,收集后续的2～3 mL滤液备用。

1.2.3 样品测定

取100μL滤液,按照1.2.1节方法处理,将灰度值比值代入葡萄糖标准曲线中,得到葡萄糖浓度,按照公式(1)计算待测样品中葡萄糖的含量。

式中:w为待测样品中葡萄糖质量分数,%;K为换算系数,0.180 16 g·mmol-1;c为葡萄糖浓度,mmol·L-1;V为萃取剂体积,L;m为待测样品质量,g;W为待测样品中水分质量分数,%。

以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果,两次平行测定结果绝对值之差不应超过5.0%。

2.1 标准曲线、检出限和测定下限

按照1.2.1节试验方法对葡萄糖标准溶液系列进行分析。结果显示,标准曲线的线性范围为0.100～4.000 mmol·L-1,线性回归方程为y＝0.446 5x＋0.547 1,相关系数为0.995 5。

按照试验方法对0.100 mmol·L-1葡萄糖标准溶液重复测定10次,分别以3倍和10倍标准偏差(s)计算检出限(3s)和测定下限(10s),结果得检出限 为 0.021 6 mmol· L-1,测定下限为0.072 mmol·L-1。

2.2 萃取剂的选择

一般来说,可直接用水将固体样品中的水溶性还原糖提取出来。烟草分析中,也有采用5%(体积分数,下同)乙酸溶液浸提[3]。按照1.2.2节试验方法,分别用水和5%乙酸溶液对样品A、B、C 进行萃取。取100μL滤液于2 mL微量离心管中,分别加入R1和R2试剂各450μL,混匀后于37 ℃水浴中反应5 min。反应结束后,将显色液转移至1 cm 光程的比色皿中,以水为参比,测定其在波长505 nm处的吸光度。结果显示,样品A、B、C经水萃取后的吸光度(3次测定平均值)均大于5%乙酸溶液的,表明用水即可将葡萄糖较好地萃取出来。因此,试验选择以水为萃取剂。

2.3 反应时间的选择

试验采用过氧化氢酶催化H2O2氧化显色底物来进行显色反应。一般来说,过氧化氢酶的最佳使用温度为37℃,超过或者低于此温度都会影响酶的活性和催化速率,因此试验选择反应温度为37 ℃。在此条件下,考察了反应时间分别为2,5,10,15,20 min时葡萄糖标准曲线的线性关系,结果见图1。

图1 不同反应时间下葡萄糖浓度对数与灰度值比值的关系曲线Fig.1 Relationship curves between logarithms of glucose concentration and ratios of gray value at different reaction times

结果显示:在不同反应时间下,显色液的灰度值比值与葡萄糖浓度呈明显的对数关系;当反应时间为2,5,10,15,20 min时,相关系数依次为0.971 5,0995 5,0.988 9,0.985 0,0.985 5,其中反应时间为5 min时的相关系数较高。因此,试验选择的反应时间为5 min。

2.4 专一性试验

按照1.2.1节试验方法对2.000 mmol·L-1葡萄糖和与葡萄糖结构类似的甘露糖、木糖、一水合鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、一水合半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸标准溶液进行测定。结果显示,葡萄糖、甘露糖、木糖、一水合鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、一水合半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸显色液的灰度值比值依次 为0.444,1.052,1.020,1.025,0.994,0.985,1.019,1.016,1.012,除葡萄糖外,其余糖类显色液的灰度值与空白溶液无明显差别,并且通过裸眼比色观察可以看到,葡萄糖显色液显示出明显的红色,而其余糖类显色液均无红色,说明该方法专一性好。这是由于葡萄糖氧化酶在有氧条件下专一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2,而对其他糖类没有影响。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对样品A、B、C 分别连续检测6次,计算测定值的相对标准偏差(RSD)。结果显示,样品A、B、C 测定值 的RSD 依次为2.2%,0.84%,3.2%,表明该方法精密度较好。

按照试验方法对样品D 进行加标回收试验,每个浓度水平测定3次,计算回收率,结果见表1。

表1 回收试验结果Tab.1 Results of test for recovery

结果显示,葡萄糖的回收率为98.3%～103%,在95.0%～105%范围内,说明该方法准确度较高。

2.6 方法对比

按照本方法和常规的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生-高效液相色谱法[21]对7个烟草样品中的葡萄糖含量进行测定,结果见表2,并通过F检验和t检验计算95%置信度下两种方法的P值。

表2 方法比对结果Tab.2 Comparison results of the methods

结果表明:本方法和高效液相色谱法测定结果基本一致;F检验时的P值为0.46,t检验时的P值为0.94,均大于0.05,说明在95%置信度下,两种方法测定结果无显著性差异。

本工作基于酶促反应和灰度分析技术,建立了一种通过颜色差异(灰度值)来测定烟草及其制品中葡萄糖含量的方法。结果表明,该方法不仅操作简便快速、分析效率高,而且精密度、准确度和专一性良好,满足行业对烟草和烟草制品中葡萄糖进行大批量、快速、准确检测的需要,具有重要的现实意义。