高脂喂养联合STZ腹腔注射对MKR糖尿病鼠心肌损伤的观察

田娜，喻嵘

1.湖南省人民医院（湖南师范大学附属第一医院）中医二科，湖南长沙 410000；
2.湖南中医药大学第一附属医院内分泌科，湖南长沙 410007

糖尿病后期合并心肌损伤，是导致糖尿病患者心衰甚至死亡的主要原因，严重影响患者的生存以及生活质量。本实验所采用的MKR鼠，为骨骼肌特异性IGF-1/Insulin双受体功能缺失鼠，具有胰岛素抵抗和β细胞功能障碍双重表现，发病快、应用简单、存活率高、稳定性好[1]，是研究糖尿病及其并发症的理想模型[2-5]。前期研究已证实MKR鼠在12周龄时出现心肌病理改变[6]。为进一步研究MKR鼠糖尿病病程中心肌损伤的表现，探索优化糖尿病合并心肌病的造模方法，本实验自2018年9月—2019年1月，以10只C57鼠和24只MKR鼠作为实验对象，观察高脂喂养结合链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）腹腔注射后的心肌损伤表现，为后期对MKR鼠糖尿病合并心肌病变的深入研究夯实基础。现报道如下。

1.1 材料来源

1.1.1 动物 C57BL鼠于湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买，实验前适应性喂养1周，合格证号：SCXK(湘)2016-0002。MKR鼠（纯合子）由美国国立卫生研究院Dr.D.LeRoith与Dr.Jun-Li Liu提供，经自然繁殖的子代用于实验观察。以上两者均饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，分别采用普通维持饲料（北京华阜康生物科技公司，货号：1022）和高脂饲料（武汉维通利华公司，货号：D12492）饲养。本实验已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.1.2 主要试剂及仪器 主要试剂有肌钙蛋白Ⅰ（Cardiac troponin Ⅰ, cTnI）试剂盒、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes, CK-MB）试剂盒（货号：AKC0325）；
STZ（货号：S0130）；
三酰甘油(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 试剂盒（货号：T9420、BC1985、C061、C063）。主要仪器有血糖仪（货号：GA-3）；
电化学发光全自动免疫分析仪（型号：Elecsys2010）；
全自动化学发光免疫分析仪（型号：CL1000i）；
正置荧光显微镜（日本NIKON公司，型号：Eclipse Ci）；
电镜（日本日立公司，型号：HT7700）。

1.2 方法

1.2.1 分组 连续普通饲料喂饲4周龄C57鼠10只（雌雄各半），并设为正常组；
连续高脂饲料喂饲4周龄MKR鼠24只（雌雄各半）。以上小鼠观察性饲养10周后，MKR鼠遵循随机、均衡原则分为模型组、空白组，每组12只。模型组MKR鼠禁食不禁水6 h，STZ溶解于柠檬酸钠缓冲液（浓度为0.1 mmol/L，pH为 4.0）中，连续 5 d以40 mg/kg的剂量腹腔注射[7]；
正常组、空白组连续5 d腹腔注射柠檬酸盐缓冲液（pH4.0）。继续观察性饲养3组小鼠至第15周。

1.2.2 标本采集与检测 ①一般情况：定时观察并记录各组小鼠的毛发、皮肤、饮食、尿液、精神状况，有无伤口、死亡情况等。②体质量及空腹血糖：（fasting blood glucose, FBG）分别于第1、10周（造模前）、第11周（造模后72 h）、第15周，小鼠禁食不禁水6 h，测量体质量，剪尾静脉采血检测空腹血糖值。③脂代谢：第15周后将小鼠麻醉后心脏釆血，血液标本于室温静置2 h，分离血清，4℃保存。采用ELISA检测，遵照试剂说明书使用步骤操作，Elecsys电化学发光全自动免疫分析仪检测TG、TC、LDL-C、HDLC。④血清cTnI、CK-MB 血清取样方式同脂代谢：采用ELISA检测，使用Elecsys电化学发光全自动免疫分析仪检测cTnI、CK-MB。⑤心肌组织病理形态：处死小鼠后迅速开胸剥离心脏，剪取约3 mm×5 mm×10 mm大小的心肌组织置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，脱水，分别制成苏木精-伊红（HE）染色切片，胶原纤维（MASSON）染色切片和过碘酸-雪夫（PAS）染色切片，光学显微镜下观察心肌组织。同时剪取左心室心肌组织切成1 mm3标本，2%戊二醛液中固定，脱水、浸透、包埋、染色，制成超薄切片，电镜下观察心肌超微结构并采集代表性图像。

1.3 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以（）表示，多组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组小鼠空腹血糖与体质量变化情况比较

第1～15周，正常组、空白组小鼠体质量均呈平稳增长趋势；
造模前，模型组小鼠体质量呈增长态势，造模后，第11、15周模型组小鼠体质量较自身第10周时期的体质量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且明显低于同期空白组小鼠体质量，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。第1、10、11、15周，模型组、空白组空腹血糖均明显高于同期正常组小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）；
造模后，与空白组对比，模型组血糖明显更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。实验期间，正常组血糖平稳，波动较小，体质量呈增长趋势；
MKR小鼠高脂喂养的情况下，空白组的小鼠血糖升高，体质量小幅平稳增长；
而经高脂喂养联合STZ造模后的MKR小鼠血糖升高显著，体重下降明显。

表1 各组小鼠体质量对比［()，g］

表1 各组小鼠体质量对比［()，g］

注：与空白组比较，△△P＜0.05；
与本组第10周比较，▲▲P＜0.05

组别正常组（n=12）空白组（n=12）模型组（n=10）第15周32.13±2.34 25.96±3.20（18.65±3.45）△△▲▲第1周25.04±2.20 21.81±2.86 22.09±2.37第10周30.86±2.05 24.45±3.77（24.78±3.77）△△第11周30.95±2.12 24.75±2.99（19.13±3.86）△△▲▲

表2 各组小鼠空腹血糖对比［()，mmol/L］

表2 各组小鼠空腹血糖对比［()，mmol/L］

注：与正常组比较，**P＜0.05；
与空白组比较，△△P＜0.05

组别正常组（n=12）空白组（n=12）模型组（n=10）第15周4.52±0.62（11.66±2.01）**（18.26±2.41）**△△第1周4.09±1.05 7.76±1.70**（8.32±1.82）**第10周4.78±0.44（10.93±2.51）**（11.15±2.80）**第11周5.02±0.50（11.58±2.27）**（17.34±3.13）**△△

2.2 各组小鼠脂代谢情况比较

与正常组比较，空白组、模型组TG、TC、LDL-C水平更高，HDL-C比正常组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组比较，模型组HDL-C水平更低，差异有统计学意义(P＜0.05)，2组TG、TC、LDL-C水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组小鼠脂代谢对比［()，mmol/L］

表3 各组小鼠脂代谢对比［()，mmol/L］

注：与正常组比较，**P＜0.05；
与空白组比较，△△P＜0.05

组别正常组（n=12）空白组（n=12）模型组（n=10）LDL-C 1.52±0.27（2.62±0.43）**（2.64±0.63）**TG 1.29±0.23（2.91±0.55）**（2.93±0.32）**TC 2.57±0.40（4.93±0.80）**（4.52±0.94）**HDL-C 1.84±0.18（1.28±0.18）**（1.01±0.30）**△△

2.3 各组小鼠cTnI、CK-MB水平比较

与正常组对比，空白组、模型组cTnI、CK-MB水平更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组对比，模型组的cTnI、CK-MB水平更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 各组cTnI、CK-MB 情况对比()

表4 各组cTnI、CK-MB 情况对比()

注：与正常组比较，**P＜0.05；
与空白组比较，▲P＜0.05

组别正常组（n=12）空白组（n=12）模型组（n=10）CK-MB（U/L）7.73±0.50（24.99±2.55）**（28.87±2.67）**▲cTnI（ng/mL）1.53±0.13（8.62±0.58）**（9.38±0.62）**▲

2.4 光镜观察结果

2.4.1 HE染色 正常组心肌细胞横纹清晰，排列有序，微血管结构清晰可辨认，间质无异常。模型组、空白组左心室心腔内存在中性粒细胞、淋巴细胞及少量炎性渗出物。空白组左心室壁可见横切肌纤维细胞肿胀，肌纤维疏松、淡染，心肌细胞中度变性、坏死；
微血管结构模糊，管腔轻度狭窄，管壁水肿。模型组左心室心内膜下渗血，左心室壁少量心肌细胞坏死，横切肌纤维细胞水肿、畸形、无序，肌纤维断裂，心肌间质增宽，可见心肌细胞变性、坏死，微血管模糊难辨，管壁增厚、肿胀，管腔狭窄。见图1-1、1-2、1-3。

2.4.2 MASSON染色 正常组心肌间质内和小动脉周分布少量胶原纤维；
空白组心肌间质内和小动脉周围胶原纤维散在分布；
模型组心肌组织内胶原沉积，胶原纤维粗大、紊乱、交错，密集分布于小血管周边。见图1-4、1-5、1-6。

2.4.3 PAS染色 正常组无明显糖原沉积情况；
空白组可见糖原沉积；
模型组大量糖原沉积。见图1-7、1-8、1-9。

图1 光镜观察结果

2.5 透射电镜观察结果

正常组心肌细胞排列有序，各细胞器形态清晰正常，胞浆内充满整齐排列的肌原纤维。基带清晰，线粒体充满胞浆，内、外膜完整连续，腔内嵴密集而整齐。空白组心肌肌原纤维紊乱，部分肌原纤维变性、溶解；
肌丝增生，明暗带欠清晰；
心肌细胞略显增大，线粒体分布不均，形态异常，嵴欠清晰，量少，但质膜未见破坏，成熟心肌细胞内可见较为完整的肌小节。模型组心肌细胞形态异常肿大、排列无序、结构缺失，肌原纤维分布失常、断裂、脱落，局部溶解；
肌丝紊乱，扭曲分离，肌节形态改变，肌纤维不连续变性，闰盘显著扩张、改变。线粒体畸形，外膜破坏，嵴稀疏、无序，局部断裂，结构模糊难辨，部分心肌细胞中线粒体消失，胞核染色质点片状凝聚，核膜断裂，分段式消失。微血管壁增厚，管腔狭窄，甚至阻塞。见图2。

图2 各组心肌组织电镜结果

目前存在多种糖尿病造模方法，除基因敲除、基因替换等手段外[8-10]，还有STZ、四氧嘧啶等化学药物诱导法、膳食诱导法等不同的造模思路[11-12]。多项研究表明小剂量连续腹腔注射STZ具有成功率高、死亡率低的优点[13-16]。黎娅等[17]发现高脂喂养12周联合STZ尾静脉注射，可成功建立2型糖尿病大鼠模型，但死亡率较高（25%）。据此，本实验以MKR转基因糖尿病小鼠为实验对象，优化造模方式，行高脂喂养联合STZ腹腔注射5日的造模。实验中，正常组、空白组均无小鼠死亡；
模型组小鼠造模期间死亡1只，第12周死亡1只。正常组小鼠皮毛富有光泽，毛发浓密、旺盛、清洁，精力充沛，反应灵敏，性情温顺。与正常组小鼠相比，空白组MKR鼠进食量、饮水量、尿量较多，垫料潮湿速度较快；
小鼠整体精神较亢奋，易躁动，攻击性较强，雄鼠喜斗殴，伤痕愈合慢；
背部毛发较稀疏，少数背部及尾部可见小片状疤痕。模型组MKR鼠在第1～10周表现同空白组一致；
第12周高脂喂养联合STZ造模后，模型组MKR鼠进食量、饮水量及尿量显著增多，垫料潮湿速度快，尿液腥臊味明显，毛发稀疏、潮湿；
雄鼠好斗殴，伤痕集中在背部及尾部，部分存在皮肤感染，伤口难以愈合，裸露出淡紫红色皮肤，实验后期精神萎靡，不喜活动，皮温偏低。实验结果表明造模成功，且经高脂喂养联合STZ腹腔注射的MKR鼠死亡率低（16.7%），与空白组单纯高脂喂养MKR小鼠的表现相比，多食、多饮、多尿，造模后的体重明显减轻，空腹血糖显著升高，与糖尿病模型特点更为贴合。

多项研究表明，TG、TC、LDL-C与心血管疾病的发生风险呈正相关，HDL-C呈负相关，对动脉具有一定的保护作用[18-20]。翟鑫等[21]发现胰岛素抵抗与TG、LDL-C水平呈正相关，与HDL-C水平呈负相关，高TG、低HDL-C水平将导致胰岛素抵抗或代偿性高胰岛素血症，而长期的高胰岛素血症又使TG和LDL-C水平升高，并使HDL-C水平降低，由此形成恶性循环，反向加重糖尿病患者的脂代谢异常和胰岛素抵抗，最终增加心血管事件的风险。本实验中模型组与空白组的MKR鼠TG、TC、LDL-C三项血脂指标均比正常组高，二者水平相当，但模型组HDL-C水平更低，由此可知，经高脂喂养联合STZ腹腔注射造模的糖尿病小鼠血糖、血脂维持在平稳的高水平状态，具备糖尿病并发心血管事件的高血糖、脂代谢异常两大高危因素，导致模型组小鼠心血管损伤更为严重。

cTnI、CK-MB、光镜及电镜观察结果表明，与正常组相比，模型组及空白组MKR小鼠均存在不同程度的心肌损伤病理表现，符合前期研究结果[6]。而进一步对比模型组和空白组的心肌损伤情况，发现同为经过高脂喂养的膳食诱导作用后MKR糖尿病鼠，采用了STZ腹腔注射造模的MKR鼠，形成了更高的高血糖状态，并在持续的高血糖、高血脂水平作用下，其心肌损伤更为严重，表现为：心肌细胞变形、坏死，肌原纤维结构破坏，线粒体减少，微血管损伤，心肌间质纤维化，心肌整体形态改变，符合糖尿病并发心肌病的特征性病理表现。由此可知，高脂喂养联合STZ腹腔注射造模可对心肌产生严重的损害，使心脏功能受损，加速糖尿病并发心肌损伤的疾病进展。

MKR转基因糖尿病小鼠作为优良的糖尿病模型鼠，已在前期实验中发挥重要作用，但心肌损伤程度较轻。本实验中改进备制方法，本实验将MKR转基因糖尿病小鼠与常用造模方法结合，强化造模效果，成功建立糖尿病并发心肌损伤特征典型且死亡率较低的模型，可为糖尿病以及糖尿病合并心肌病模型的建立提供新方向，以便进一步研究该疾病的防治。