大鼠磨牙牙髓血运重建术后血管内皮生长因子的,表达及意义

王 芹 李立恒 王钟华 杨永超 冯建梅 胥爱文 安 峰 申叶春

（河北北方学院附属第一医院口腔科，张家口 075000）

牙髓血运重建技术通过彻底有效的根管消毒，尽量保护残留牙髓组织、牙髓干细胞和根尖乳头干细胞等，形成以血凝块为主的再生支架并提供生长因子，最后进行严密的冠方封闭，为干细胞增殖和分化提供良好的环境，从而促使牙根继续发育[1]。血管生成是从已有的毛细血管发展成新血管的过程。它是一个基本的生理过程，对胚胎发育、排卵和伤口修复至关重要，与关节炎、糖尿病视网膜病变和肿瘤生长等病理条件有关[2]。血管内皮生长因子（VEGF）在血管生成中起着中心作用，促进新毛细血管的形成，对内皮细胞增殖、迁移和存活至关重要[3]。在生理和病理条件下，VEGF的调节对许多组织的新生血管形成至关重要[3]。研究表明，VEGF在牙髓干细胞向内皮细胞的分化中起着关键作用，可促进牙髓干细胞的存活，分化内皮细胞的增殖和血管的出芽以及通透性[4]，但VEGF在牙髓血运重建后的表达及其分子机制仍不明确。为了更好地了解牙髓血运重建术后VEGF在根尖周组织中的表达规律，本研究拟通过建立大鼠磨牙牙髓血运重建术动物模型，观察牙髓血运重建术对VEGF的影响。

1.1 动物模型建立

30只6 ～ 8 周龄健康的 SPF 级雌性 SD 大鼠，体重 （177.83±11.04） g，由广东医学动物实验中心提供。将30只SD大鼠随机编号分成实验组、对照组及空白组，各组具体操作如下：

（1）实验组：水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，牙科显微镜下对术区消毒和清理（图1A）。利用无菌手术器械将第一磨牙开髓，沿近远中方向去髓，生理盐水和1.25%NaClO交替冲根管内洗残留牙髓组织，用针损伤根尖刺激出血（图1B），用生理盐水棉签止血，待其凝固后使用三氧化物多聚体（MTA）覆盖血凝块面，以流动树脂进行填充（图1C）。（2）对照组：将下颌第一磨牙开髓，牙髓腔直接开放于口腔环境3周形成根尖周炎。（3）空白组：大鼠牙齿不做任何处理。

图1 牙科显微镜下磨牙牙髓血运重建动物模型建立

术后每日观察下颌第一磨牙填充物情况，如若脱落则需重新进行牙髓血运重建。

1.2 标本采集

在牙髓血运重建术后3周麻醉处死大鼠，剥离下颌第一磨牙及其周围组织，一部分用100%甲醇或4%多聚甲醛在4℃下固定24 h，经脱钙、脱水、透明、浸蜡后包埋；
另一部分组织置于液氮中保存。

1.3 HE染色

包埋的石蜡标本沿着牙齿颊舌面做连续切片（厚度为5 μm），经脱蜡复水后用苏木精-伊红进行HE染色，光学显微镜下观察组织形态。

1.4 VEGF基因表达检测

将置于液氮中的磨牙组织研磨至粉末状后，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）按照说明书提取总RNA。采用iScript-cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，美国）合成cDNA。用SYBR-Green PCR试剂盒（Bio-Rad公司）进行实时荧光定量PCR扩增反应，并使用CFX-96快速实时PCR系统（Bio-Rad，美国）进行检测大鼠源性VEGF基因的表达，引物序列见表1。PCR产物经熔融曲线分析验证。使用2-ΔΔct方法，通过管家基因Actin-β值计算靶基因的相对表达水平。

表1 RT-PCR引物序列信息

1.5 VEGF免疫组化染色

石蜡切片放置在载玻片上，在60℃培养箱中过夜，在二甲苯中脱蜡并通过分级醇（100%，95%，75%）再水化。将抗大鼠VEGF一抗（Cell Signaling Technology ，美国）以1∶100稀释后滴加在组织切片上孵育，4℃过夜。孵育完毕后TBST洗去一抗，用过氧化物酶偶联二抗在室温下避光孵育1 h后与3， 3′-二氨基联苯胺（DAB）底物-染色原反应孵育2 min。孵育好的切片用苏木精复染3 min，通过分级醇脱水。最后在切片上滴加中性树脂，用盖玻片封片，应用光学显微镜观察组织中VEGF蛋白的表达。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料用±s表示，实验样本间均数比较采用两样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

实验期间动物进食、活动情况良好，未观察到实验磨牙牙体断裂或填充物脱落。

2.1 HE染色结果

术后3周的HE染色结果显示：空白组的牙髓为松散的结缔组织，内含血管、纤维等其他细胞外基质，胶原纤维有序排列，根尖孔未完全闭合，呈开放状。对照组坏死的牙髓组织充满整个组织髓腔和根管，根管内有明显的炎症细胞浸润，根管内未见新生组织形成。与对照组相比，进行了牙髓血运重建术的实验组大鼠磨牙根管内未见明显炎症细胞浸润，根管内长满新生组织，内含血管样结构，组织结构上更接近正常牙髓结构，见图2。

图2 3组大鼠下颌第一磨牙HE染色（100×）

2.2 VEGF基因表达水平结果

如图3所示，在3组大鼠磨牙组织样本中观察到，VEGFmRNA在牙髓血运重建术后中的表达水平显著提高（P＜0.01），而VEGFmRNA在对照组中的表达水平下调明显（P＜0.01）。

图3 各组VEGF的基因表达情况

2.3 VEGF免疫组化染色结果

石蜡切片VEGF免疫组化染色显示：部分细胞呈褐色（如图4），VEGF在空白组、实验组、对照组中均呈有表达，与空白组和对照组相比， 实验组牙髓组织内腔周围观察到一些VEGF强阳性细胞，表明新生血管形成；
与空白组相比，对照组中VEGF阳性较弱。按VEGF阳性率从高到低的排序是实验组＞空白组＞对照 组。

图4 3组大鼠下颌第一磨牙VEGF免疫组化染色（200×）

显微牙髓血运重建术是用于治疗年轻恒牙牙髓坏死的方法。通过在显微数字技术下操作，彻底有效地根管消毒后，尽量地保护牙髓干细胞、牙乳头间充质细胞和牙周韧带干细胞。然后利用根管内血凝块，提供良好的干细胞增殖和分化微环境，达到促进牙根继续发育的目的[5]。牙髓血运重建的种子细胞来源主要为牙髓干细胞、根尖乳头干细胞、牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞[6]。这些干细胞在信号分子、盖髓剂MTA等诱导下拥有不同的分化潜能，可以形成牙髓、牙本质和牙周韧带[7]。Stambolsky等人发现对犬类进行牙髓血运重建术后，未成熟犬齿牙髓显示出血管再生[8]。成牙本质细胞是高度分化的细胞，能产生大量的蛋白质，为此，持续需要大量的氧气和营养，因而牙髓细胞对血管破裂导致的血液供应中断反应灵敏，从而导致细胞坏死[9-10]。

在本研究中，对照组大鼠磨牙经过开髓暴露牙髓后，石蜡切片HE染色发现髓腔内产生大量坏死细胞以及根尖周出现炎症细胞浸润，而进行了牙髓血运重建术的实验组大鼠则可看到根管内有丰富的血管新生，未见明显炎症细胞浸润，在组织结构上更接近正常牙髓结构，表明牙髓血运重建术促进了牙髓内血管的新生并且减少了炎症细胞的浸润。牙髓血运重建术后3周的RT-PCR结果显示：大鼠磨牙组织中VEGF基因表达水平显著提高，磨牙组织免疫组化染色结果也证明牙髓腔内出现了比空白组和对照组更大量的VEGF阳性细胞，证实了血管的新生。VEGF可促进牙髓内血管生成，增加牙髓内微血管密度。VEGF可能是在牙髓组织破坏时产生的缺氧条件下分泌的[11-12]。众所周知，缺氧刺激的HIF-1α是VEGF的有效转录因子[13]。VEGF可能在牙髓血运重建术后被牙髓干细胞诱导分泌，从而触发局部牙髓血管生成[14]。

本文初步证明，牙髓血运重建术可显著促进大鼠磨牙中VEGF的表达，从而促进牙髓中血管的生成和牙髓组织的修复，由此提示：VEGF在临床牙髓坏死和根尖周炎治疗中具有潜在的应用价 值。