Wilhelmy吊片法测定磷脂溶液的表面张力等温线

李远非，杨训方，王桂玲，郭莹，王煦，李馨儒，周艳霞，谢英

北京大学药学院，北京 100191

随着药剂学新技术的发展，新型药物递送系统如脂质体(Liposomes)[1]、脂质乳(Lipid emulsions，LE)[2]、胶束(Micelles)[3]以及脂质纳米粒(Lipid nanoparticles，LNPs)[4]等，在解决药物溶解度、保护药物稳定性、实现靶向递送以及提高药物治疗指数等方面具有显著的优势。在这些药物递送系统中，磷脂作为重要的组成部分起到了关键作用。其不仅可通过自组装形成稳定的类细胞膜结构囊泡用以装载药物[1,3]，还可作为表面活性剂降低纳米粒与水之间的界面张力[2,4]，从而起到稳定纳米粒的作用。

磷脂作为双亲性分子，是一种有代表性的表面活性剂。磷酸甘油酯(phosphoglycerides，PG)是磷脂的主要存在形式[5]，其分子包含一个亲水极性头部和两个疏水尾部，甘油骨架上1和2位羟基被脂肪酸酯化，3位羟基被连有其他基团的磷酸基酯化(如图1所示)。磷脂的表面活性与疏水脂肪酸的种类和亲水端磷脂酸的极性有关，通常以芘探针法测定临界胶束浓度表征其表面活性[6]。随着界面张力仪的应用开发，采用Wilhelmy吊片法[7]测定磷脂溶液的表面张力等温线能够获得更多的分子性质信息，如表面超量、临界胶束浓度以及分子横截面积等，这对于选择磷脂种类、设计新型磷脂分子构建新型药物递送系统具有一定的指导意义。

图1 磷脂种类和分子结构

在目前的药学本科实验教学中，关于表面性质的教学内容主要采用最大泡压法测定乙酸的表面张力等温线[8]。该实验研究体系简单、测定方法单一，不能满足现代教学要求。随着新型表面活性剂的出现和科学测量仪器的进步，及时更新教学内容，使学生掌握先进的实验技术和数据处理方法，对于提升学生的实验兴趣，提高实验教学质量，培养药学创新人才具有重要意义。本文采用界面张力仪研究磷脂溶液的表面性质，不仅能为磷脂的选择应用提供参考信息，还对于其他表面活性剂的评价具有一定的借鉴价值。

(1) 使学生掌握界面张力仪的操作原理和使用方法；

(2) 学会数据处理，绘制表面张力等温线，并计算磷脂的表面超量和分子横截面积。

Wilhelmy吊片法[7]测定液气界面张力是基于垂直悬浮在界面中的铂片上的拉力、表面张力、重力和浮力之间的平衡作用(如图2所示)：

图2 Wilhelmy吊片法测量原理示意图

式中L为铂片与液面接触的周长，约为铂片宽度的2倍；
θ为接触角，因铂片经过特殊处理，接触角θ → 0，故cosθ ≈ 1；
d为铂片浸入液面的深度，实验过程中先将铂片浸没于溶液中，然后提升至浸没深度d = 0时保持静止，进行测量。

因此，测量拉力F与表面张力σ的关系式为：

测量过程中，首先将铂金片安装在界面张力仪上，归零，即F = mg，此时，σ = 0；
当铂金片浸入样品溶液后，界面张力仪测得F，经过仪器内算法的换算，溶液的表面张力可在界面张力仪中直接读出。

3.1 仪器和材料

二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC，MW= 790 Da，S01005，日本精化)和二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC，MW= 733 Da，S01004，日本丘比) (上海艾伟拓医药科技有限公司)；
氯仿、无水乙醇(北京市通广精细化工公司)；
样品槽(C5227-60 mm，表面积S = 2.826 × 10-3m2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，超纯水系统(Synergy，法国密理博)；
表面张力仪(Sigam703D，Biolin Scientific AB，瑞典)。

3.2 样品溶液配制

分别准确称量DSPC和DPPC，以氯仿为溶剂配制2.0 mg∙mL−1的DSPC和DPPC溶液。

3.3 溶液表面张力的测定

① 室温(25 °C)下，将界面张力仪在空气中调零，向样品槽中加入40 mL超纯水，升高样品台，使铂金板浸入液面以下3 mm左右，然后缓慢降低样品台直到铂金片下沿恰好与液面持平，待仪器示数稳定，记录数值，为水的表面张力；

② 用10 μL微量进样器在铂金片附近水气界面上加入1 μL样品溶液(如图3所示)，待仪器示数稳定，记录溶液的表面张力数值；

图3 磷脂溶液动态表面张力测定示意图

③ 重复步骤②，继续在同样位置加入1 μL样品溶液，记录溶液表面张力；
直至随加入样品量增加，溶液表面张力不再显著降低，实验结束。

④ 下降样品台，轻轻取下铂金板，用乙醇清洗后再用酒精灯烧结处理后备用。用蒸馏水清洗样品槽3次，加入超纯水，重复步骤①、②、③，测定下一个样品溶液。

3.4 数据处理

① 记录加样体积对应的表面张力；

② 采用OriginPro 2019b软件绘制样品溶液的表面张力–加样量(σ–m)曲线；

③ 在σ–m曲线表面张力快速下降区和稳定区分别做线性关系拟合，解二元一次方程组求同解，得到磷脂溶液的最低表面张力σmin和饱和吸附质量mmax(μg)；

④ 根据下式求算饱和吸附量Γm(mol∙m−2)，以及估测磷脂分子横截面积A (m2)。

其中MDSPC= 790 g∙mol−1，MDPPC= 733 g∙mol−1，S = 2.826 × 10-3m2。并通过式(4)计算磷脂分子的截面积。

其中LA= 6.02 × 1023mol−1。

4.1 DSPC和DPPC的表面张力等温线

DSPC与DPPC在结构上具有相同的亲水基头部，仅DPPC中两条疏水基烃链较DSPC少2个亚甲基(分子结构如图4A所示)。以氯仿为溶剂，2.0 mg∙mL−1的DSPC或DPPC持续加入至水中均造成溶液表面张力的迅速下降(如图4B、C所示)，符合表面活性剂的表面张力曲线特征。

图4 (A) DSPC和DPPC的分子结构；
(B) DSPC溶液表面张力等温线；
(C) DPPC溶液表面张力等温线

4.2 DSPC和DPPC的表面性质

根据DSPC和DPPC溶液表面张力等温线，计算得到两种磷脂的表面性质参数，如饱和吸附质量mmax、饱和吸附量为Γm和分子横截面积A，如表1所示。

表1 DSPC和DPPC的表面性质参数

从结果可见，与DSPC比较，DPPC饱和吸附量Γm较高，分子横截面积较小，与其分子结构相符合。DPPC分子横截面积与Chaban V[9]采用计算模拟测得的结果相一致，说明测定方法具有一定的可靠性。

磷脂在水溶液中的溶解度较低，易溶解在氯仿、乙醇等有机溶剂中[5]。采用界面张力仪测定磷脂水溶液的表面张力，需先将其溶解在有机溶剂中，然后滴加在水相进行测定[9]。有机溶剂的加入有可能对磷脂溶液表面张力测定产生一定的影响。本文选择了氯仿作为溶剂来测定磷脂溶液的表面张力等温线，在具体教学实践中，也可以选择乙醇作为溶剂进行磷脂溶液表面张力等温线的测定，进行拓展性实验。也可以安排学生对采用氯仿和乙醇为溶剂测量的结果进行比较，说明导致两者的行为出现差异的原因。此外，改变磷脂的氯仿溶液的浓度，也会影响表面张力的测量。可以安排学生准确称量适量DSPC，以氯仿为溶剂配制10.0 mg∙mL−1、2.0 mg∙mL−1、0.4 mg∙mL−1DSPC溶液，采用3.3小节方法测定溶液的表面张力，并安排学生分析溶液浓度影响表面张力测量的原因，加深对表面膜结构模型及其对表面张力影响的理解。拓展实验可在12学时内完成。

以磷脂作为代表性表面活性剂，应用界面张力仪测定了DSPC和DPPC溶液的表面张力等温线，计算了相应的表面性质参数。该实验操作性强、数据重现性好、实验体系稳定，能够在4学时内完成。通过对传统实验的改进，可以实现物理化学实验与科研前沿的对接，使实验内容与药学的衔接更加紧密，有利于激发学生的学习兴趣，更好地理解表面活性剂的性质，提升学生分析问题和解决问题的能力。通过拓展实验，也可以将该实验拓展设计成综合实验，探究溶剂的选择对于磷脂溶液表面张力等温线测定的影响，可以让学生理解体系中的分子相互作用，学会为表面活性剂测定体系选择合适的溶剂。对于培养学生探索表面活性剂功能和结构的关系，提高分析问题解决问题的能力具有积极的意义。