合成生物学细胞传感技术在食品安全快速检测中的应用

陈晓琳 刘洋儿 许文涛 郭明璋 刘慧琳

（1.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048；
2.中国农业大学营养与健康系，北京 100083）

开发新一代食品安全检测技术是构建从“从农田到餐桌”全链条食品安全监管体系，进一步提升我国食品安全水平的关键。食品安全检测技术主要分为仪器分析法和快速检测法两大类，基于色谱、光谱等原理的仪器分析法是目前食品安全抽检监测部门所使用的主要方法，具有灵敏度高、准确性好等优点，但操作复杂、成本高、检测时间长，不适合现场及大量样品的筛选和快速测定［1］。快速检测法是利用靶标待测物的化学或生物学性质所开发的，操作简单、成本低廉、可以短时间内完成检测的方法。相比于仪器分析法，快速检测法不仅可以提升抽检监测部门的工作效率，更可用于企业、商超、消费者的食品安全自检自测，对于完善食品安全监管体系具有重要意义。

近年来，食品安全快速检测技术在国内外科学家的共同努力下取得了长足的进步，其中利用抗原抗体特异性识别、适配体特异性识别、核酸特异性扩增等原理所开发的快速检测技术发展尤为迅速［2］。这些技术检测快速、操作简便，但仍然需要在以下方面进行提升：首先，由于食品基质成分复杂，这些技术通常需要配合复杂的预处理步骤，导致操作复杂性增加，总检测时间增长；
另一方面这些技术所使用的抗体、适配体、核酸扩增酶和引物等物质生产纯化费时费力，导致检测成本增高。细胞传感技术是一种新兴食品安全快速检测技术，它是以活体细胞为感应元件，感应被测量并按照一定规律转换为可识别信号的检测装置［3］。由于细胞具有代谢调控能力，无论外部环境如何变化，细胞始终保持相对内稳态，为靶标识别和信号转化提供了稳定的环境，因此细胞传感器对环境的抗干扰能力通常较强；
由于细胞具有自我繁殖能力，传感器细胞内部所有基因元件可以通过基因复制和细胞增殖而自动扩增，因此细胞传感器在生产上具有简单、廉价、快速的特点。上述优点使细胞传感技术在食品安全快速检测中具有良好的实际应用前景。

合成生物学的发展为细胞传感技术的应用提供了新的契机。合成生物学是指人们将基因按照一定规律连接成网络，让细胞来完成人为设计的各种任务［4］。与传统的基因工程技术通过改造某个特定基因而获得所需要的细胞品系不同，合成生物学技术将细胞视为“微型机械”，对细胞的改造更类似于机械设备中元器件的搭建。因此，合成生物学与细胞传感技术在理论思想方面具有高度一致性。合成生物学为细胞传感器提供新的功能元件、模块器件以及组装理论。本文将对基于合成生物学的细胞传感技术发展及应用案例进行综述，并对合成生物学与食品安全技术的发展趋势进行展望。

细胞传感器的感应元件主要包括转录因子和核糖开关，转录因子是一类能与基因上游特定序列专一性结合，从而影响基因转录的蛋白质分子，核糖开关是某些mRNA 非翻译区的序列折叠成一定的构象。这两类分子均可特异性结合某种或某类化学物质并导致自身三维构象发生变化，转录因子构象变化后，其与基因的启动子区域的结合能力改变，从而促进或抑制基因的转录过程，而核糖开关构象变化后，其茎环排布发生改变，暴露或隐藏mRNA 的核糖体结合位点，从而开启或关闭mRNA 的翻译过程。感应元件与待测物质的结合能力，决定了细胞传感器的灵敏度和特异性，因此筛选合适的感应元件是构建细胞传感器的关键。

1.1 转录因子

目前已经发现的原核生物转录因子约有300 多种，细胞传感器设计者可以在CollecTF1、P2TFA、porTF 等原核生物转录因子数据库中查找识别某种待测靶标物质的转录因子（表1）。然而在食品安全领域，大部分需检测的危害物质并没有相对应的已知转录因子，需要从自然界生物体内筛选新的转录因子，甚至人工构建自然界中不存在的转录因子。随着基于高通量测序的转录组学技术的发展，筛选新转录因子的效率大幅提高。例如，Shi 等［25］为了筛选丁醇的转录因子，将丁醇及其类似物丙醇、乙醇等分别加入酵母细胞，进行转录组学分析，找出特异性响应丁醇，而不响应乙醇、丙醇的启动子，并将其与红色荧光蛋白基因结合，在酵母细胞中构建了检测丁醇的全细胞生物传感器。

表1 常见靶标物质的细胞传感器感应元件Table 1 Sensing elements in whole-cell biosensors for common target substances

对于难以找到理想的天然转录因子的靶标物质，合成生物学提供了人工改造甚至从头构建转录因子的策略，常见的方式有截短、嵌合、功能域突变、全蛋白突变、从头设计等。（1）截短，即通过缩短已知转录因子的长度来改变其性能。例如，Tao等［26］通过截短转录因子CadR 来优化其对镉离子和汞离子的特异性。该研究分别从C 端去掉CadR的10 个和21 个氨基酸来自获得了CadR-TC10 和CadR-TC21，并将其作为感应元件控制绿色荧光蛋白基因的表达，构建识别镉离子和汞离子，而对锌离子识别减弱的大肠杆菌全细胞生物传感器。（2）嵌合，即将一种转录因子的靶标识别功能域与另一种转录因子的基因表达调控功能域相结合，从而获得一种特异性好、基因表达调控能力强的新转录因子。例如，Mendoza 等［27］利用嵌合的方式开发了一种对汞离子特异性好、灵敏度高的全细胞生物传感器。该团队将转录因子GolS77 的金离子识别功能域替换为MerR 的汞离子识别结构域，构建成为GolS*转录因子。GolS*转录因子与Hg2+结合后可以促进PgolB 启动子控制的绿色荧光蛋白基因的表达，从而将检测金离子的全细胞生物传感器改造为检测汞离子的全细胞生物传感器。（3）功能域突变，即对转录因子中的功能域（能独立存在的功能单位）进行位点特异性突变。例如Kasey 等［28］对MphR 转录因子识别结构域中与大环内酯类物质直接结合的5 个氨基酸位点进行随机突变，构建成所有5 个氨基酸位点的饱和突变库QCMS5，从中筛选了一种对大环内酯类物质特异性更好、灵敏度更高的突变体转录因子。利用该突变体转录因子构建的全细胞生物传感器，可实现大环内酯类药物生物合成基因通路的高通量定向进化。此外，D’Oelsnitz 等［29］对RamR转录因子与黄连素结合的氨基酸位点进行诱变，构建突变文库，挑选最佳突变体转录因子，开发了四氢生物碱的高度特异性和灵敏度的生物传感器。（4）全蛋白突变，即将原有转录因子的蛋白随机突变筛选出有正向作用的突变体。例如，Chong 等［11］通过对dmpR 基因的易错PCR 扩增，将随机突变引入整个DmpR 蛋白，从中筛选出性能更好的特异性响应有机磷的转录因子，证明了在转录因子功能域外的氨基酸位点突变也有助于增加其诱导表达水平。（5）从头设计，即利用酶对底物识别的功能域、抗体对抗原识别的功能域等部件，从头创造自然界中不存在的转录因子［30-31］。例如，Chang 等［30］提出了一种基于单体DNA 结合域融合的单域抗体的通用框架来从头设计针对新靶标配体的转录因子的策略。

对于改造或从头设计的转录因子，合成生物学也提供了高效筛选的方案，例如，Liu 等［32］将转录因子性能与细胞麦芽糖利用能力相偶联，形成了新型筛选策略。与传统的基于抗生素耐药性筛选策略相比，基于麦芽糖利用能力的筛选适应性更强，即使经过多次选择，逃逸风险也要低得多。Jia 等［33］设计了双向筛选技术，以获得对铅离子响应灵敏度较高，且不受锌离子干扰的PbrR 转录因子突变体。在正向选择中，PbrR 转录因子与氨苄青霉素抗性基因amp的表达相偶联，在培养液中加入铅离子，利用氨苄青霉素筛选出对铅离子灵敏度较高PbrR 突变体；
在反向筛选中，PbrR 转录因子与果聚糖合酶基因sacB相偶联，在培养液中加入锌离子，利用蔗糖筛选出对锌离子灵敏度较低PbrR 突变体。

1.2 核糖开关

2002年人类发现第一个核糖开关，目前为止已知的天然核糖开关仅有20 余种［34］。原核生物中核糖开关主要有3 种类型：（1）适配终止子模式。当细胞内无靶标物质时，基因上游的5"非编码形成抗终止子结构，RNA 聚合酶可以顺利完成基因编码区的转录。当细胞内有靶标物质时，靶标物质结合核糖开关，破坏了抗终止子的稳定性，而形成终止子发夹结构，导致RNA 聚合酶从mRNA 分离，关闭基因表达。（2）适配RBS 模式。当细胞内无靶标物质时，核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）被隐藏在茎环结构中，核糖体无法结合到mRNA 上而无法翻译。当靶标结合核糖开关后，茎环结构被打开，暴露出核糖体结合位点，开启蛋白翻译。（3）适配核酶模式。当靶标物质结合到核糖开关区域后，激活核酶的自切割活性，导致mRNA 降解，从而阻断蛋白质的翻译过程。以核糖开关作为感应元件的细胞传感器案例目前较少，例如Wang 等［35］将特异性响应钴/镍离子的核糖开关与红色荧光蛋白mCherry 基因相结合，开发出高灵敏度和高选择性的钴/镍离子全细胞生物传感器。

对于自然界中不存在天然核糖开关的靶标物质，可以通过筛选、改造等方式开发人工核糖开关，而RNA 合成生物学技术的发展为核糖开关的智能靶向设计提供了新的契机。通过体外筛选得到的能与靶标物质进行高亲和力和强特异性结合的核酸短链被称为适配体。适配体的三维构象与其所处的体系环境具有密切关系，如何保证体外环境中筛选的适配体在传感器细胞内正确折叠仍是该领域需要突破的技术瓶颈。Jang 等［36］通过体外-体内双重筛选解决这一问题，开发了一种人工己内酰胺核糖开关，灵敏度达到50 mmol/L，并可用于筛选工业生产菌株以提高己内酰胺的产量。该团队［37］以及Xiu 等［38］又利用该策略筛选得到了特异性响应柚皮素的核糖开关。然而该体外体内双重筛选策略工作量大，成功率低，无法从根本上解决适配体的细胞内应用问题。深入研究适配体序列、构象、环境之间的关系，才是从根本上解决这一问题的关键［34,39-40］。

细胞传感器的报告元件是指传感器细胞中生成人类或已有仪器可识别信号的元件。报告元件通常为蛋白质，也有少量为功能核酸。目前已经发展成熟和正在研发的各类报告元件可分为八类（图1）。

图1 细胞传感器报告元件种类Fig.1 Types of reporter elements used in whole-cell biosensors

2.1 荧光素酶

自然界中能够与氧气反应产生荧光的物质统称为荧光素，该反应的速率在没有酶催化的情况下非常慢，而生物体内许多能够在钙离子作用下大大加快这一反应速率的酶，统称为酶荧光素酶（luciferase），常用作报告元件的荧光素酶包括细菌荧光素酶（bacterial luciferase，Lux）、萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Luc）和水母素（aequorin）等。

2.2 荧光蛋白

荧光蛋白一般由单个基因表达，蛋白自身可以产生稳定的荧光，不需要任何底物，除了溶氧外，其表达和荧光强度基本不受底盘细胞代谢的影响，这些优点使荧光蛋白成为最理想的细胞传感器报告元件。现阶段，90%以上的合成生物学细胞传感器使用荧光蛋白作为报告元件。在荧光蛋白的选择方面，细胞传感器的设计者需要考虑如下因素［41］：第一，荧光蛋白在底盘细胞中能够有效表达并成熟，并且能提供最够强度的荧光信号；
第二，荧光蛋白在检测过程中要保持光稳定性；
第三，荧光蛋白对底盘细胞应是没有毒性的；
第四，荧光蛋白应该对检测体系的环境因素不敏感。

2.3 荧光适配体

RNA 适配体荧光报告元件是指与无荧光或弱荧光靶物质结合后能形成强荧光复合物的适配体。RNA 适配体荧光报告元件信号输出的过程则只需要经历“转录”的过程，理论上，RNA 适配体报告元件的信号输出所需时间更短。在长度上，由于蛋白元件的每个氨基酸对应DNA 上3 个碱基，而RNA元件的每个核糖核酸对应DNA 上的1 个碱基，RNA元件所对应的基因通常更短。在元件设计上，RNA比蛋白质在裁剪、劈裂、拼接等方面都更加便利。因此，RNA 适配体作为报告元件具有独特的优势。目前可用作报告元件的荧光适配体有孔雀石绿荧光适配体（malachite green aptamer）［42］、菠菜绿荧光适配体（spinach aptamer）［43］、芒果黄荧光适配体（mango aptamer）［44］、西兰花荧光适配体（broccoli aptamer）［45］。

2.4 色素报告元件

色素（microbial pigments）是一类由微生物或动植物产生的次级代谢产物，因其具有特殊的化学结构，能够对光线造成反射、干涉、散射或吸收等效果，而呈现出不同的颜色。虽然色素本身不是蛋白类物质，但其合成受到色素生成酶的严格控制，因此可以作为合成生物学细胞传感器的报告元件。与荧光蛋白报告元件相比，微生物色素报告元件产生的输出信号是人类肉眼可见的，因此更适合用于可视化细胞传感器的开发。常见的微生物色素包括类胡萝卜素［46］、黑色素［47］、灵菌红素［48］、紫色杆菌素［49］、靛蓝素［50］等。色素报告元件的性能，取决于传感器底盘细胞中底物的存在情况，由底物到产物所需的基因元件数量，从底物到产物颜色变化在视觉上的显著性等。

2.5 气体报告元件

对于不透明的样品，如土壤、谷物等，较难利用光学报告元件进行检测，故近年来出现了以气体的生成作为输出信号的全细胞生物传感器，由于气体可以自发集中到检测体系的顶空，因此无论在透明介质还是不透明介质中均可应用。常见的气体报告元件［51］如norB基因（催化生成一氧化二氮）、efe基因（催化生成乙烯）［52］、mht基因（催化生成卤甲烷）［53］、dsr基因（催化生成甲硫醇）。

2.6 磁小体（magnetosome）

1975年，美国人R.P.Blakemore 首次发现了一类运动方向能随外加磁场极性改变而变化的细菌，并将其命名为趋磁细菌（magnetotacitic bacterium）。随后科学家陆续发现多种类型的趋磁细菌，发现它们细胞内都含有生物膜包被，单磁畴级晶体铁磁颗粒，称为磁小体。目前磁小体尚不能在大肠杆菌等工程菌株中表达，若随着磁小体生成机制的深入研究［54］，这一技术瓶颈得以突破，则可以将大部分基因整合到大肠杆菌基因组上进行组成型表达，将少数几个关键基因作为信号输出元件进行诱导表达。当靶标物质存在时，传感器细胞能产生完整的磁小体，从而释放磁信号，通过检测磁性强弱，反映靶标物质的浓度。

2.7 冰核蛋白

自然界存在一类细菌能在-5℃--2℃诱发植物细胞水结冰而发生霜冻，这类细菌称为冰核细菌。冰核细菌能产生一种特殊的蛋白质，具有特定的重复序列，可以使水分子排列成冰核，进而形成规则、细腻和微小的冰晶，这类蛋白被称为冰核蛋白。冰核蛋白报告元件提供了一种延时检测的方法。由于冰核蛋白结构比较稳定，保存时间较长，故可以将产生冰核蛋白的过程与检测冰核蛋白的过程进行分离。冰核蛋白报告元件的优点是将对样品物性的要求降到最低，缺点是检测过程比较繁琐，且无法实现动态实时监测［55-56］。

2.8 Curli蛋白

大肠杆菌和沙门氏菌（Salmonellaspp.）的生物膜中含有名为Curli 的功能性淀粉样蛋白，它们可以在细胞外自组装成纳米级纤维蛋白。研究表明，Curli 和类似的功能性淀粉样蛋白是一种关键性生物膜成分，能够促进基底的黏附、生物膜的结构强化和宿主细胞的入侵。Tay 等［57］利用特异性响应汞离子的转录因子MerR 控制curli基因的表达，构建了检测汞离子的全细胞生物传感器。该传感器细胞与样品进行孵育后，上清的OD 值与汞离子浓度呈现负相关性。

感应元件和报告元件通过基因表达调控的方式相偶联，即可构建成为简单的细胞传感器基因回路（图2），用于单一靶标物质的直接检测。若要实现细胞传感系统的信号放大、多元检测、延时报告等复杂功能，则需要借助于其他功能元件或由几个相关功能元件组成的完成某一任务的功能模块，构建成为复杂的细胞传感器基因回路。合成生物学理论和技术的发展，正是推动简单基因回路向复杂基因回路演进的主要动力。

3.1 信号放大

合成生物学细胞传感器在检测各种食品污染物方面具有很大的潜力，然而细胞传感器的检测限通常较高，检测时间较长，常常不能满足实际需要。为了解决这个问题，在基因回路中加入模式化的信号放大模块是一种有效的方案（图2-A），能够将检测限降低2-3 个数量级，并且也可以在一定程度上提高检测速度。

图2 合成生物学细胞传感器的基因回路Fig.2 Gene circuits of whole-cell biosensors in synthetic biology

3.1.1 基于转录因子叠加的放大信号 Karig 等［58］为了放大qsc 启动子对酰基高丝氨酸内酯（AHL）的响应，使Placlq启动子控制rhlR基因的表达，高效的cl（LVA）抑制基因置于qsc 启动子的下游，同时λP（R-O12）启动子控制荧光报告基因的表达，将这三部分基因回路进行串联，构建信号放大基因回路。当外源性C4HSL 扩散到细胞内并与rhlR基因表达的RhlR 受体蛋白结合，C4HSL/RhlR 复合物激活qsc 启动子，导致Cl 蛋白的产生，Cl 蛋白会调控基因eyfp的表达水平。

3.1.2 基于正反馈回路的信号放大 反馈可以放大对诱导剂的响应，并产生二进制输出和滞后，是许多基因回路调节中常用的机制。正反馈也被用来增强细胞和组织特异性启动子的转录活性，为增强基因表达提供了一种方法。例如，Sayut 等［59］利用人工正反馈环（PFLs）来实现信号放大，作者利用LuxR 在高浓度的3-氧-己酰高丝氨酸内酯（OHHL）存在下可以激活PluxI 启动子，构建了正反馈的基因回路。在基因回路中，外源添加的OHHL 会导致LuxR 激活PluxI 启动子，从而导致LuxR 和gfpuv 的表达，而LuxR 表达的增加进一步增强了PluxI 启动子的活性，导致正反馈，从而增强了弱启动子的反应实现了信号放大。

3.1.3 通过信号串联实现信号放大 使用核糖开关在大肠杆菌的敏感菌株和报告菌株之间启动信号传递，与核糖开关直接控制荧光表达相比，增加了配体结合产生的荧光量。例如，Goodson 等［60］使用一个核糖开关调节信号分子C4，该分子可被“放大器”细胞类型的启动子（“PRhl”）检测，激活绿色荧光蛋白的表达。与核糖开关直接控制荧光表达相比，增加了配体结合时产生的荧光量。

3.1.4 基于质粒拷贝数核糖开关信号放大 控制质粒的拷贝数可以增强荧光信号。Dwidar 等［61］设计并构建了一个双核糖开关质粒，在单个质粒上引入两个配体激活的核糖开关，对相同的配体作出反应。一个核糖开关控制目的基因，另一个控制质粒复制，配体的加入导致目的基因的表达量增多以及质粒拷贝数的增加，从而使核糖体开关在基因表达的动态范围内表现出显著的改善。

3.1.5 利用几种方式集合的方法构建信号放大系统 例如，Wan 等［62］通过3 种方法联合开发了一种新颖的模块化传感器信号放大方法，设计了超灵敏的砷和汞细胞传感器，将检测限和输出分别提高了5 000 倍和750 倍，第一种方法是调节传感模块中的细胞内受体蛋白密度，以增加传感器的灵敏度，即改变感应元件中组成型启动子（PC）的强度，受体蛋白的密度由PC启动子的强度决定（启动子越弱传感器的灵敏度越高，动态范围越大），且受体蛋白与配体结合后将抑制同源启动子PR的表达，抑制绿色荧光蛋白的产生；
第二是在计算模块中设计一个高增益转录放大器，该放大器放大来自PR启动子的传感器信号，从而增加检测范围；
第三种方法是串联多个这样的放大器来放大传感器信号并进一步提高了传感性能。

3.2 逻辑计算（逻辑门）

多元靶标检测是细胞传感器的发展趋势之一。当一个细胞传感器检测多个靶标时，可以构建并行检测通道，即每一种靶标对应一种信号报告元件；
也可以进行信号整合，即将多个靶标的检测结果，通过逻辑运算整合成一个报告信号。实现逻辑运算的模块被称为逻辑门，常见的逻辑门包括与门（AND Gate）（图2-B），或门（OR Gate）（图2-D），非门（NOT Gate）（图2-E），或非门（NOR Gate）等。与门的运算规则为当所有靶标均为阳性时产生报告信号，或门的运算规则为所有靶标中任意一个为阳性即产生报告信号，非门的运算规则为检测靶标均为阴性时产生报告信号，或非门为所有靶标均为阴性时产生报告信号。合成生物学利用核糖开关、转录因子、重组酶等元件构建了基因线路的逻辑门模块，可以实现细胞传感器多元靶标检测时的逻辑运算及信号整合。

3.2.1 基于核糖开关的逻辑门 RNA 工程系统为许多生物体的基因表达提供了简单而通用的控制，其中核糖开关的设计和实现提供了一个独特的机会来操纵顺式反应器中的任何报告装置，以低代谢成本执行严格的时间和空间控制。这种由核糖开关调节的设备组装成高阶遗传电路，可以有效地处理逻辑运算。核糖开关即设置特定的RNA 序列，使其可以形成特定环状结构，此结构可以与一些抗生素进行结合从而不再与核糖体结合，从而阻止了翻译的进行。例如，Schneider 等［25］采用了著名的ROC 分析，并推导出了一种新的逻辑门性能指标。从新霉素和四环素结合核糖开关开始，设计了一个能够传递NOT 和NOR 逻辑行为的阻遏门。单个输入对应于NOT 逻辑；
将两个核糖开关进行“串联”形成NOR逻辑门。当四环素和新霉素分子不存在时可以结合核糖体进行翻译表达绿色荧光蛋白，四环素和新霉素存在一种以上都不能结合核糖体不表达绿色荧光。

3.2.2 基于复合型转录因子的逻辑门 原核生物中存在一些由不同组分组装构成的复合型转录因子，如异源二聚体转录因子以及某些需要伴侣组分的转录因子。将不同靶标物质对应复合型转录因子的一种组分的表达，即可构建AND 型逻辑门。例如，Moon 等［65］利用InvF 转录因子及其伴侣蛋白SicA构建了AND 逻辑门。InvF 转录因子及SicA 单独存在时均不具有开启报告元件基因表达的能力，但二者同时存在时，可以组装形成转录因子复合物，结合到相应的启动子上开启报告元件基因的表达。将两种靶标物质分别控制InvF 和SicA 的表达，即可形成只有在两种靶标物质同时存在时才会产生报告信号的AND 逻辑门细胞传感器。

3.2.3 基于Toehold 的逻辑门 Green 等［63］设计了一种转录因子的逻辑门模型“核糖计算”系统。由全新设计的部件组成，通过可预测和可设计的碱基配对规则运行，减少扩散介导的信号损失，降低代谢成本，并提高电路可靠性。其将RNA 设计为环状结构不够紧密的“发卡”结构，而可以与环中一段RNA 完全互补配对的一段RNA 称为反义RNA，有反义RNA 存在时设计的RNA 不形成环状结构而与其结合表达荧光信号。将几种环状结构“串联”即可形成OR 逻辑门，将其“并联”即可形成AND 逻辑门，添加两段方向相反的反义RNA 即可组成NOT逻辑门。

3.2.4 基于荧光适配体劈裂的逻辑门 Alam 等［66］提出了二进制“Split-Broccoli”系统作为一个独立的RNA 逻辑门，并作为一个监测RNA 的设备在体内进行RNA 杂交。Split Broccoli 是第一个在体内运行的功能性分裂适体系统。Split-Broccoli 系统的两条自主RNA 链被指定为顶部和底部。这两条链都不包含形成功能性西兰花单体所需的完整序列，而且都不会折叠成类似功能性单体的二级结构。以这种方式设计分裂花椰菜系统，其中只有在存在两条或两条底部链（输入）的情况下，才能激活，从而创建一个能够完全作为RNA 执行和报告逻辑操作的“AND”门。

3.3 记忆元件

基于合成生物学的记忆元件的构建一般有两种方式（图2-C），例如Kotula 等［67］使用了最常见的一种实现方式，一个切换开关，其中阻遏器抑制彼此的表达，一个记忆状态对应于一个阻遏器的支配，维持记忆状态的反馈回路需要连续使用能量和材料来进行转录和翻译，类似于电子电路中的易失性记忆；
第二种方法是利用重组酶结合两个识别位点，并将中间的DNA 转化，对应于这两个方向的状态即使在细胞死亡后也会保持。例如Yang 等［64］用不可逆的大型丝氨酸噬菌体（LSTP）整合酶，该整合酶参与介导噬菌体在其同源识别位点——attB（细菌）和attP（噬菌体）之间整合和切除到细菌基因组中，通过LSTP 整合酶切割、旋转和重新连接DNA，将这些位点放置在相反的方向上，使位点之间的区域反转，构建了一个能够记录211（2 048）种状态组合（1.375 bytes 的信息）的存储阵列。

微生物细胞易于培养，繁殖迅速，代谢相对简单，因此现阶段微生物细胞是合成生物学细胞传感器的主要细胞类型。近年来，受到无细胞蛋白表达系统的启发，合成生物学“无细胞”（Cell-Free）或称“拟细胞”生物传感器被开发出来，利用细胞破碎液、细胞抽提液或人工配制的细胞模拟液作为合成生物学基因回路的工作环境。

4.1 微生物细胞传感系统

工程化大肠杆菌基因背景清楚，质粒工具和基因编辑工具丰富，生长迅速，培养成本低，相对安全。基因组简化的大肠杆菌可以进一步减少背景基因的干扰，降低潜在的安全风险，提高细胞传感器的工作效率［68］。大肠杆菌的生存环境较为广泛，在一般的样品环境下可以完成检测功能，但在一些较为特殊的检测环境，或者对食品安全性要求较高的检测环境下，大肠杆菌并非最佳选择。选用样品中原始存在的菌株作为传感器的底盘细胞，可能更加有利于检测结果的稳定性和准确性。（1）在土壤样品的污染物检测中，除了大肠杆菌，还可以选用一些土壤原生菌株，包括农杆菌［56］、希瓦氏菌［53］、假单胞菌［69］、肠杆菌［55］、罗尔斯通氏菌［70］等。（2）在发酵产品的原位实时检测中，可以选用发酵菌株，如莽草酸发酵过程中利用谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）构建细胞传感器［71］，麦纳醌发酵过程中利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）构建细胞传感［72］，柚皮素发酵过程中利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）构建的细胞传感器［73］。

4.2 拟细胞传感系统

拟细胞传感系统的建立主要涉及细胞破碎以获取细胞提取液的过程，常见的细胞破碎方法包括冰浴超声破碎、球磨破碎、液氮破碎、电激破碎等。在破碎后的提取液中，加入人工构建的带有合成生物学基因回路的质粒以及必要的补充物质，即可构建成拟细胞传感体系［74］。与微生物细胞传感系统相比，拟细胞传感系统打破了细胞界限，突破了细胞壁和细胞膜的限制，这为其带来了以下的优势：首先，省去了待测靶标物质穿过细胞壁和细胞膜的过程，提升了检测效率；
其次，可以更容易地实现对检测体系离子环境的调控，对于某些在细胞内较难应用的生物元件或方法，如体外筛选的适配体、细胞内易被降解核酸元件，以及基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、CRISPR-Cas9 的交叉方法等［75］，在拟细胞传感系统中更加容易应用；
再次，对于一些具有遗传毒性、氧化应激毒性的有毒靶标物质，拟细胞传感器受到的影响相对较小，毒性抗性更强。然而完整细胞体系的破坏，也导致了细胞传感器的一些传统优势的丧失，如拟细胞传感器生产成本的提升，对检测环境变化的抵抗能力较差等。总之，细胞传感器和拟细胞传感器各具优势，在今后有可能形成两条不同的发展路线。

4.3 商业化呈现形式

基于合成生物学的细胞或拟细胞传感器具有成本低，抗干扰能力强，操作简单，安全可靠等优势，因此理论上很适合在食品安全现场检测领域的应用。若要构建可商业化的现场检测方法，必须将合成生物学细胞传感器在一定平台上进行呈现。可与合成生物学细胞传感器对接的便携式平台有试管（图3-A）、口罩（图3-B、E）、手环（图3-C）、可穿戴设备（图3-D）、试纸（图3-F）、芯片［76］等。大部分合成生物学细胞传感器在研发阶段是在试管中进行的，在商业化应用中，细胞或拟细胞传感系统可以冻干后储存在试管中，在使用时通过加水活化，加入预处理的待检样品进行检测。细胞传感器和拟细胞传感器也可以冻干固定化在滤纸、消化纤维素膜等纸基材料中制备食品安全检测试纸条，使用时将样品与稀释液混合，滴加在试纸条上进行检测［77］，与试管相比，试纸条成本更低、更加便携和安全。最近，Nguyen 等［78］报道了将细胞或拟细胞传感器整合到轻质、柔性底物和纺织品中，并利用这些制品做成了手环、服装等可穿戴设备。将合成生物学细胞传感器整合到可穿戴设备中，可以扩大其对生理状态、疾病状态和暴露于病原体或毒素的非侵入性监测的能力。

图3 基于合成生物学细胞传感器的商业化呈现形式Fig.3 Commercial presentation forms of whole-cell biosensors based on synthetic biology

5.1 合成生物学细胞传感器面临的挑战

与其他食品安全快速检测方法相比，合成生物学细胞传感器在检测速度上存在劣势。以细菌为底盘细胞的传感器从加样到读数约需要20 min 至数小时，而以酵母等真核微生物为底盘细胞的传感器这一过程需要数小时至数天。这方面的技术突破需要依靠合成生物性功能核酸元件的开发与应用，例如适配体感应元件、RNA 信号放大元件、荧光适配体报告元件等。其次，合成生物学细胞传感器作为一种转基因微生物及其制品，环境释放后的生物安全性需要进一步保障。在商业化现场检测应用中，传感器细胞的基因回路片段很难完全破坏，置于环境中存在转移并整合到其他微生物基因组内的可能性，导致生物安全性风险。这方面的技术突破需要依靠合成生物学细胞传感器与纳米材料技术的结合。再次，合成生物学细胞传感器在知识产权方面如何保障是其商业化过程中需要解决的重要问题。购买者在得到商业化合成生物学细胞传感器产品后，很容易从产品中分离细胞并自行扩增培养，而不会再次购买同类产品。这方面的技术突破可以通过对底盘细胞的改造，构建需要依赖特殊营养因子的传感器细胞，使购买者在无法得知特殊营养因子种类的情况下，无法自行扩增培养传感器细胞。

5.2 合成生物学细胞传感器的发展方向

合成生物学细胞传感器未来将向着靶标多元化、功能扩展化、设计智能化的方向发展。所谓靶标多元化，即每个细胞传感器可以检测多种靶标物质，以此大大提高检测效率。多元化的实现，依赖逻辑计算基因回路将多个靶标信号的整合，并且需要解决各个靶标的信号之间的串扰问题。所谓功能扩展化，即合成生物学细胞传感器除了检测功能外，还可以通过让传感器细胞表达蛋白酶、脂肪酶、植酸酶等以完成食品有机物消化功能，以及通过表达催化靶标反应的酶完成靶标转化功能，通过这些功能扩展，可以进一步简化合成生物学细胞传感器所需的样品预处理的过程。所谓设计智能化，是指通过功能基因元件数据库，标准化元件接口，以及自动化设计工具，完成合成生物学细胞传感器基因回路的智能化、定制化设计。