外泌体lncRNA在结直肠癌液体活检中的研究进展

姚刘旭, 李玉红, 蒋宗明

1.绍兴市人民医院 麻醉科，浙江 绍兴 312000；

2.绍兴文理学院 医学院，浙江 绍兴 312000；
3.浙江树人大学树兰国际医学院附属树兰(杭州)医院 麻醉科，浙江 杭州 310004

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)已经成为世界上第三大常见的恶性肿瘤，病死率排名第二[1]。目前肿瘤诊断的金标准是组织活检，但由于其有创性，患者依从性差，存在一定的局限性。而常用的两种血液生物标志物：癌胚抗原(carcinoma embryonic antigen, CEA)和碳水化合物抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9, CA19-9)，由于敏感性和特异性不高，不是理想的早期诊断指标[2]。因此，寻找敏感性及特异性更高的生物标志物用于早期检测CRC，提高患者的生存率具有重要意义。近年来，可重复的无创性检查方法如液体活检受到了研究者的广泛关注。

液体活检是对从生物液体中收集的各种类型的细胞和分子进行取样和分析，分析的细胞和分子包括各种RNA、蛋白质、肽、代谢产物和外泌体等，液体活检可以获得多种多样的信息， 有助于不同疾病(包括癌)的诊断、预后，显示出巨大的临床潜力[3]。已有几种类型的液体活检证明了它们在CRC诊断、预后和治疗预测中的潜在作用，如循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)[4]。外泌体是存在于生物体液中的天然载体，其含量丰富，在循环中稳定存在，包含多种生物活性物质，可作为生物标志物及治疗靶点，既往研究已经证实外泌体可在多种疾病中发挥不同的调控作用[5]。长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)由于其常在包括恶性肿瘤在内的各种疾病类型中发生表达改变，已经成为近年来的研究热点[6]。越来越多的研究显示液体活检中外泌体lncRNA可应用于CRC早期诊断和预后的检测。

本文中对外泌体lncRNA在CRC进展中发挥作用的分子机制，以及其在液体活检中作为CRC生物标志物的作用进行综述，并探讨外泌体在临床应用中存在的不足和挑战。

胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是存在于血液、唾液、尿液等生物液体中的细胞分泌的纳米颗粒，具有细胞间通讯的作用[7]。外泌体是直径<100 nm的胞外囊泡，含有多种生物活性物质，主要是蛋白质、核苷酸和脂类。这些生物活性物质通过自分泌、旁分泌和内分泌方式从供体细胞转移到受体细胞，并发挥特殊功能。外泌体的磷脂双层膜包裹外泌体中的多种生物活性物质，避免其被细胞外液中的蛋白酶降解，使外泌体中生物活性物质能够被稳定检测[8]。外泌体可以保护其内容物免受外界环境的影响。有些外泌体已显示出单独检测CRC的早期诊断潜力，能够作为CRC不良预后和化疗耐药预测的生物标志物。

lncRNA是一个长度在200～10 000 nt的长链非蛋白编码RNA家族，具有进化保守性，其表达受到严格调控，并能够调控基因的表达[9]。作为最大的一类非编码转录本，lncRNA具有广泛的功能。通过与DNA、RNA和蛋白质的不同相互作用，在染色体重构[10]、组蛋白修饰[11]、DNA甲基化[12]等方面发挥着重要作用。LncRNA参与肿瘤发生和进展的各个阶段，包括肿瘤发生的启动、肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移、侵袭转移、血管生成。lncRNA通过调控Wnt/catenin[13]、EMT[14]、AKT/mTOR[15]等多种致癌信号通路发挥作用。总之，lncRNA的表达改变影响了许多生物学功能，在肿瘤形成过程中起着关键作用。

2.1 UCA1促进CRC细胞的增殖、转移、耐药

lncRNA UCA1(urothelial carcinoma-associated 1, UCA1)与包括CRC在内的多种疾病的发生发展有关。既往研究显示UCA1在CRC患者血清外泌体中表达增高，通过外泌体转移至CRC细胞，增强细胞的增殖和迁移能力。UCA1作为竞争内源性RNA(ceRNA)，竞争结合miR-143调节肌球蛋白Ⅵ(myosin Ⅵ, MYO6)的表达，进而促进CRC的恶化[16]。然而有研究得出不一致的结论，UCA1在CRC患者的肿瘤组织中增高，血清外泌体中降低[17]。UCA1的不对称分布可能是由于CRC细胞通过限制外泌体的分泌以减少UCA1形成。UCA1通过控制ceRNA网络而成为CRC进展的RNA调节因子。在UCA1转录起始位点上游存在转录因子结合位点(transcription factor-binding sites, TFBSs)，其中UCA1可以通过与转录因子CCAAT/增强剂结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein beta,CEBPB)结合来控制转录。此外，UCA1还能与miRNA相互作用，保护mRNA不被降解，与mRNA 3′-UTRs结合提高mRNA的稳定性，促进CRC细胞的增殖。UCA1可能参与化疗耐药，UCA1在西妥昔单抗耐药的CRC细胞及其外泌体中表达明显升高，外泌体可将UCA1从西妥昔单抗耐药细胞转移到敏感细胞，来自西妥昔单抗耐药细胞的外泌体可将耐药性传递给敏感细胞并改变敏感细胞的UCA1表达水平，导致敏感细胞对西妥昔单抗耐药更大。UCA1在CRC进展期患者中的表达明显高于部分缓解或完全缓解患者，血液中含有UCA1的外泌体可预测CRC患者西妥昔单抗治疗的临床结果，这说明外泌体lncRNA UCA1可作为CRC患者西妥昔单抗耐药的分子标志物[18]。总之，UCA1可用于CRC诊断、预后和耐药的标志物，亦可作为治疗靶点，但关于外泌体中lncRNA UCA1在CRC中更多的作用机制还不完全清楚，需要进一步的临床和基础研究。

2.2 CRNDE促进CRC增殖和预后价值

lncRNA CRNDE[19](colorectal neoplasia differentially expressed, CRNDE)存在多个亚型，在正常结直肠组织中低表达，但在结直肠腺瘤和腺癌中均高表达。CRNDE-p是CRNDE的一个亚型，CRNDE-p和miR-217表达存在负相关，且高水平CRNDE-p引起CRC患者不良预后，CRC患者血清外泌体中CRNDE-p水平在化疗前后发生改变，其中的潜在机制需要进一步的研究来阐明。外泌体CRNDE对CRC的诊断能力检测显示，其敏感性和特异性优于CEA，具有作为CRC患者的诊断和预后标志物的潜力。CRNDE-h是另外一种亚型，丰富存在于CRC外泌体中，CRNDE-h与RAR相关受体-γt(RAR-related orphan receptor, RORγt)结合，通过抑制其与E3泛素连接酶Itch的结合，抑制RORγt的泛素化和降解，以增加Th17(T helper 17)细胞比例、RORγt表达和IL-17启动子活性，促进Th17细胞分化，进一步促进CRC细胞增殖[20]。

2.3 RPPH1促进CRC细胞增殖、转移和诊断价值

lncRNA RPPH1(ribonuclease P RNA component H1, RPPH1)是核糖核酸酶P(RNase P)的RNA成分，在多种疾病中发挥作用。RPPH1在体内外均可促进CRC转移，RPPH1通过与miRNA β-Ⅲ微管蛋白(TUBB3)相互作用，诱导CRC细胞上皮间充质转化(EMT)。过表达或敲低CRC细胞来源的外泌体中RPPH1水平与亲代细胞中变化一致。CRC细胞来源的外泌体将RPPH1转运至巨噬细胞，介导巨噬细胞M2极化，巨噬细胞吞噬外泌体后，抗炎因子水平上升，促炎因子水平下降，通过增加循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)的数量进而促进CRC细胞的增殖和转移。CRC患者手术前血清外泌体RPPH1水平较高，而肿瘤切除后则较低。与传统的肿瘤标志物CEA和CA199相比，CRC血清外泌体RPPH1具有更好的诊断价值(AUC=0.86)，有望成为新的治疗靶点和诊断标志物[14]。

2.4 H19促进CRC细胞的干性和耐药性

lncRNA H19最初被定义为癌胚抗原转录本，在多种恶性肿瘤中发挥致癌作用。CRC患者成纤维细胞(CAFs)来源的外泌体中H19的水平高于相应纤维母细胞(NFs)来源的外泌体，H19可从CAFs转移到CRC细胞中并促进CRC细胞的干性。与NFs来源的外泌体相比，CAFs来源的外泌体catenin蛋白水平显著提高，而敲除H19则catenin蛋白水平降低，且H19与miR-141存在相互作用，说明CAFs来源的外泌体中H19通过在CRC中作为miR-141的ceRNA，进一步激活Wnt/β-catenin通路。来自CAFs的外泌体能够促进CRC细胞对奥沙利铂的耐药性，从而证实CAFs通过转移外泌体H19促进CRC肿瘤干细胞的干性和化疗耐药性[21]。然而，CRC患者血清来源外泌体中H19的低表达与不良预后相关，这与H19的促癌作用相反[22]。因此，有关H19在CRC发生发展中的分子机制及其预后作用还有待进一步探究。

2.5 其他外泌体lncRNAs在CRC中的诊断和预后作用

lncRNA LINC02418在CRC患者外泌体中显著高表达，敲除LINC02418通过诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡抑制CRC细胞增殖，LINC02418作为ceRNA激活母系胚胎亮氨酸拉链蛋白激酶(maternal embryo leucine zipper protein kinase, MELK)，通过降低MELK抑制剂miR-1273g-3p水平发挥致癌作用[23]。血清外泌体中的lncRNA HOTTIP(HOXA transcript at the distal tip, HOTTIP)和HULC(highly upregulated in liver cancer，HULC)的低表达与CRC的不良预后相关，具有作为CRC不良预后生物标志物的潜力[22]。lncRNA CCAT2[24](colon cancer-associated transcript 2, CCAT2)在CRC患者血清外泌体中高表达，且与不良临床表现及预后相关，CCAT2在外泌体中稳定表达，与血清中表达水平无明显差异，提示外泌体是CCAT2在血清中稳定性的潜在保护因子。外泌体lncRNA在CRC中的作用需要更广泛及深入的基础和临床研究证实。

液体活检打破了传统检查方法的局限，非侵入性检查将成为肿瘤诊断筛查的新趋势。越来越多的证据表明，外泌体lncRNA在CRC的肿瘤发生发展和治疗耐药中具有不同作用。外泌体中的lncRNA由于其包膜结构可以避免外界环境的影响，作为肿瘤生物标志物比无包膜lncRNA更具优势。从血液样本中分离的外泌体显示出对疾病早期的诊断潜力，具有特异性的TNM分期预后潜力，以及对CRC临床常见治疗方案耐药的预测潜力。

目前分离外泌体的技术仍存在一定局限性，最常用的分离外泌体的方法是超速离心法[25]，为了获得更高纯度的外泌体，也可以使用蔗糖梯度离心法和免疫分离法，再使用流式细胞术验证外泌体表面蛋白，但这种方法只能分离出特定的外泌体，并且需要大量的工作，耗时长，且测定效率不高，无法广泛地应用于临床。而一些研发的外泌体分离试剂盒使用聚乙二醇等聚合物破坏外泌体膜，不能分离出完整的颗粒，从而限制了定性和定量分析。研发出更简便更灵敏的技术分离纯化外泌体，有助于外泌体lncRNA检测早日投入临床应用。建立用于分离、纯化和鉴定外泌体的指南，确保临床前研究转化为临床试验是仍需攻克的难题。