蒜氨酸药用制剂与生物活性研究进展

裴天容 李明强

1 遵义医科大学第一附属医院急诊科(遵义 563003) 2 遵义医科大学微免实验室(遵义 563003)

大蒜为百合科，葱属植物的地下鳞茎，富含多种微量元素及生物活性成分。对大蒜药用成分的研究早期以大蒜素抗菌作用进入人们的视野，主要有二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物、二烯丙基四硫化合物等，具有独特的臭味和刺激性，且不稳定,均为脂溶性物质。大蒜素脂溶性特征使其临床制剂的配制过程中必须使用有机溶剂、助溶剂、增溶剂，对机体带来毒性影响[1]，导致制剂的临床使用受限，达不到预期临床效果。为此人们将目标成分转移到水溶性成分，大蒜素前体物质-蒜氨酸。蒜氨酸为S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜,是大蒜特有的含硫氨基酸成分,性能稳定，水溶性。在蒜酶、代谢酶以及热分解条件下，蒜氨酸均可分解生成脂溶性有机含硫化合物，即大蒜素[2- 5]。蒜氨酸制剂的研制不需要有机溶剂、助溶剂、增溶剂，与脂溶性大蒜素相比具有显著优越性，制剂无毒副作用，能提高体内的药物浓度，实现蒜氨酸与大蒜素的生物活性作用。近年来人们越来越重视蒜氨酸的研究，研究报道日渐增多，已成研究热点。本文就蒜氨酸分离提取、制剂及其生物活性研究进展进行综述，以供参考。

1.1 蒜氨酸的分离提取

现有研究报道蒜氨酸分离提取方法，按处理大蒜温度不同分为三类，加热法、冷冻法和保留蒜酶活性法，加热和冷冻都是免除蒜酶活性作用进行的分离提取方法。按蒜氨酸分离方式不同可分为醇沉法、柱层析色谱法和透析酸沉淀法。

醇沉淀法其原理是利用溶液中加入另一种溶剂改变溶液的极性，导致某些成分溶解度降低析出沉淀。很多物质的提取都可采用醇沉法，如蛋白、核酸、酮、糖类等[6- 8]，醇沉淀法的影响因素较多，溶液蒜氨酸浓度、醇的最终浓度、醇沉淀时间、醇沉淀温度、醇沉淀次数对蒜氨酸提取均有很大影响。有研究报道醇沉淀法分离纯化蒜氨酸，蒜氨酸沉淀率为87.8%，多糖沉淀率为 65.5%，蛋白沉淀率可达91.6%；
为此有先将溶液进行超滤后醇沉淀分离研究，消除大分子物质的影响，也排除不了很多小分子，如糖、酮、苷等物质影响，不得不进行重结晶纯化蒜氨酸[9-14]。将醇沉淀与超滤、蒜氨酸等电点、重结晶相结合，纯度可以提高到60%～90%蒜氨酸；
93%的提取率为大蒜中可检测到的游离蒜氨酸的百分率[12-14]，大蒜中游离氨基酸含量为1%～3%，也有研究不同醇沉条件对蒜氨酸提取率影响，提高蒜氨酸的提取率，也只是溶液中蒜氨酸检测计量的百分率，游离氨基酸的提取率[14-17]。这些均充分显示了醇沉淀法存在严重不足，并且醇沉法所需的时间过长，需要多次醇沉，乙醇消耗量大，排渣也较困难，操作繁琐。

柱层析法是在管道容器内填充不同物质作为固定相，流动液体以一定的速度流动，带动溶质流动，用不同方式导致溶质流动的速率不同而分离溶质。有离子交换柱层析法、吸附层析法和色谱层析法。离子交换柱层析法是利用离子交换剂来进行分离，蒜氨酸是两性化合物，在一定的 pH 溶液中蒜氨酸带相同电荷，多糖和其他小分子物质不带电，因此可用离子交换树脂来吸附蒜氨酸，这样也能实现蒜氨酸与其他成分分离。阳离子交换树脂分离纯化蒜氨酸，提高纯度到40%～64.5%的蒜氨酸制品[9]。葡聚糖凝胶柱层析是根据凝胶内部孔径大小不同，溶质分子大小差异在柱内流动速率不同达到分离目的。用葡聚糖凝胶G-10层析法纯化蒜氨酸，纯度可达43.5%[10-12]。高效液相色谱法由非极性固定相和极性流动相组成，用高效液相色谱仪分离经离子交换树脂柱分离纯化的蒜氨酸洗脱液，经色谱柱分离，得到蒜氨酸纯度高达99.62%[18]。柱层析分离蒜氨酸本质是将分离提取的蒜氨酸溶液进行纯化的方法，管道空间有限，操作也较为繁琐，更不适于制备蒜氨酸药用制剂规模生产所用。

蒜氨酸为大蒜氨基酸成分，在蒜体内主要以结合状态存在，在蒜酶的作用下分解为游离蒜氨酸。加热法将大蒜加热灭活蒜酶，冷冻法将大蒜于液氮(-196 ℃)冷冻 ,抑制蒜酶活性分离提取蒜氨酸，提取的只是大蒜中极微量游离蒜氨酸[9-18]，只有将大量的结合蒜氨酸游离才能有效提高蒜氨酸提取效率[19]。透析酸沉淀法是利用透析袋具有分子筛的作用，将大于透析袋孔径的物质滞留于透析袋内，小于透析袋孔径的小分子物质进入透析液中；
采用透析法分离小分子物质有两个优势，其一透析为结合蒜氨酸的游离提供时间和条件，其二透析没有外力的作用，不会出现膜孔的堵塞阻碍透析物质的通过，小分子物质由于膜内外物质浓度差进行扩散通过透析膜。精确滴定透析液pH，不带电荷的成分不会产生沉淀，等电点不同的带电荷小分子也不会产生沉淀，可精确沉淀蒜氨酸，从而提高蒜氨酸纯度。透析酸沉淀法提取蒜氨酸，蒜氨酸的提取效率为使用大蒜计算可达到25%以上，纯度高达99.9%的蒜氨酸。该法操作简便，流程少，生产不受器材限制，可规模生产。但是在大蒜匀浆过程中能否激活蒜酶活性将结合蒜氨酸充分分解成游离蒜氨酸是提高蒜氨酸提取效率的关键所在。

1.2 蒜氨酸制剂

蒜氨酸口服液以保健食品获得生产批文《国食健字G20040800》，是以蒜氨酸命名的保健食品。大蒜和食用醋酸匀浆过滤液，含较低浓度的蒜氨酸、大蒜素。通过动物体内急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、精子畸形试验和30 d喂养试验，证实该口服液安全无毒[20]。

蒜氨酸、蒜酶双层包芯片是将蒜酶层粉末填入冲模中以9 mm平头预冲压后，填入处方量蒜氨酸层粉末再以9 mm冲头进行二次冲压制成双层包芯片[21]。设计原理是当药片进入肠道，外衣膜溶解，蒜酶将蒜氨酸裂解为大蒜素，经肠道吸收进入机体发挥药理作用。蒜酶具有热不稳定性和pH不稳定性，葡萄糖强烈抑制蒜酶活力，同时蒜酶对蒜氨酸的分解是酶催化反应，受到蒜酶活性、底物浓度与反应物浓度影响[22- 24]；
局部高浓度大蒜素引起肠道黏膜炎症反应，对肠道消化吸收功能有较大影响[25]。未见进一步研究报道。

蒜氨酸微丸是蒜氨酸提取物用50%的乙醇溶液溶解，加入微粉硅胶做抗粘剂，取空白丸芯，采用流化床底喷技术制备而成[26]。蒜氨酸提取物中蒜氨酸纯度不高，在加入50%乙醇、硅胶粉、空白丸芯，蒜氨酸就成为制剂中的微量元素，更未见进一步研究报道。

蒜氨酸注射液通过透析酸沉淀法提取[19]，直接配制浓度为100 mg/mL蒜氨酸溶液，纯度可达到99.99%，并于2017年12月24日获专利授权。经小鼠尾静脉注射蒜氨酸的最大给药剂量达2 g/kg体质量时，未见小鼠死亡，这说明蒜氨酸安全性较高[27]。免疫毒性研究显示[28]，单独使用蒜氨酸注射不会导致机体免疫系统发生针对蒜氨酸的免疫反应，无免疫毒性。蒜氨酸注射液注射剂量达到或超过200 mg/kg体质量，连续多次用药后，其代谢产生较高浓度大蒜素可导致红细胞脆性增加，但无溶血现象[29]。蒜氨酸注射液能够大剂量注射进入机体，提高体内大蒜素与蒜氨酸药物浓度，实现临床治疗的需要。

蒜氨酸分子含有硫醚基、烯丙基、氨基、羧基多种功能基团，具多种生物活性如与大分子蛋白非特异性结合、抗氧化活性、调节免疫功能、脱氨基脱羧基后形成大蒜素，发挥多种药理作用。

2.1 蒜氨酸与蛋白质非特异性结合

蒜氨酸能够与蛋白质发生非特异性结合[28- 31]，蒜氨酸与蛋白之间的作用主要为静电引力，与色氨酸和酪氨酸残基间疏水作用力，使蛋白质的构象发生改变[30- 31]。这种结合为可逆性结合，当溶液中游离蒜氨酸浓度降低，结合蒜氨酸从蛋白质分子中游离，形成游离蒜氨酸[29]，蒜氨酸能通过被动转运进入细胞内。

在研究蒜氨酸抗菌作用时，发现蒜氨酸体外不具杀菌活性，但蒜氨酸与菌体蛋白、细菌酶蛋白结合阻止细菌与环境物质交换，抑制细菌酶活性，具有强大的抑菌活性；
细菌缓慢的生命活动又可分解蒜氨酸，形成大蒜素，加强蒜氨酸抑菌效应；
当细菌离开蒜氨酸环境，即可正常生长繁殖。蒜氨酸大于2.5 mg/kg剂量注入家兔体内治疗家兔脓肿模型，检测脓汁标本中死菌率与活菌率，发现蒜氨酸杀菌作用与4×104U/kg剂量的青霉素比较无统计学意义，是蒜氨酸在体内分解成大蒜素的结果[32]。由此可见蒜氨酸与病毒或易感细胞表面蛋白非特异性结合,能否阻断病毒与易感细胞表面受体结合，切断病毒复制增殖途径，发挥抗病毒作用，有待进一步研究证实。有研究报道蒜氨酸用于2019年的新型冠状病毒引起的病毒性肺炎，表明蒜氨酸可抑制新型冠状病毒主要蛋白酶(SARS-CoV- 2 Mpro)表达，对SARS-CoV- 2的预防和治疗具有一定指导意义[33]。

2.2 蒜氨酸抗氧化活性

蒜氨酸抗氧化实验研究显示清除超氧阴离子自由基和羟基自由基，在保护细胞免受自由基损伤过程中有潜在的药用价值[34- 37]。蒜氨酸可提高机体器官、组织、细胞抗外来化学药物的毒性伤害；
蒜氨酸能清除组织细胞因代谢过程中产生过氧化物、超氧阴离子自由基和羟基自由基，增强组织细胞抗代谢产物、化学毒物的毒性伤害。在进行蒜氨酸对小鼠急性肝损害的影响研究时，给予小鼠蒜氨酸灌胃，能有效提高小鼠抵抗化学药物对肝脏的损害作用[38]；
蒜氨酸能显著降低高血脂小鼠血液胆固醇、甘油三酯水平，抑制3一羟- 3一甲戊二酸单酰辅酶A还原酶活力，提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD酶)活力，体现较好的降脂能力；
提高葡萄糖体内平衡,增加胰岛素敏感性，改善糖、脂代谢[39]；
蒜氨酸通过促进自噬活动减轻心肌缺血再灌注对心肌细胞的损伤，降低体内细胞凋亡，对心血管疾病有积极有效作用[40- 42]。蒜氨酸使小鼠大脑组织中SOD酶活性增高，诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 蛋白表达量减少,改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力[43]。蒜氨酸能降低活性氧的生成，下调NADPH氧化酶1的表达，是一种潜在的治疗骨质疏松症的药物[44]。还可见蒜氨酸用于化妆品显示保护皮肤，提高上皮细胞抗衰老作用[45]。显示了蒜氨酸可提高组织细胞抗氧化、抗衰老的生物活性，在解毒、调节机体生理机能、改善糖脂代谢、心血管疾病、老年痴呆等中老年疾病的预防与治疗中具有广泛的应用价值。

2.3 免疫调节作用

蒜氨酸在体外实验证实蒜氨酸能抑制同型半胱氨酸诱导巨噬细胞受体CD36表达；
用蒜氨酸进行小鼠灌胃饲养，能增加免疫小鼠淋巴细胞溶血空斑数量、提高吞噬细胞吞噬功能与增强小鼠第Ⅳ型超敏反应强度，提高细胞免疫功能；
蒜氨酸明显抑制肺髓过氧化物酶活性、抑制支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β 表达，减轻脂多糖全身急性肺损伤，具有抗炎作用[46- 50]。蒜氨酸给予家兔耳缘静脉注射治疗金黄色葡萄球菌感染家兔脓肿模型时，发现蒜氨酸使家兔吞噬细胞吞噬百分率显著升高，白细胞介素- 2、白细胞介素- 7显著高表达，家兔抗金黄色葡萄球菌抗体效价显著升高，显著提高脓肿模型家兔的抗感染能力[51]。表明蒜氨酸对机体免疫功能的调节作用体现在提高吞噬细胞吞噬功能，提高免疫因子表达，调节体液免疫与细胞免疫功能，增强机体免疫防御、免疫监视与自身稳定能力。

2.4 蒜氨酸分解成大蒜素发挥药理作用

蒜氨酸为大蒜素前体物质，在蒜酶的作用下分解成大蒜素，采用蒜氨酸加蒜酶进行实验研究，开启了蒜氨酸药理作用研究[52- 54]。近年来的研究表明，蒜氨酸的分解动力学以及热分解产物分析认为，蒜氨酸容易在加热条件下分解，过程中会形成一个五元环的过渡中间体，而后生成二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等挥发性含硫化物，说明即使在蒜氨酸酶不存在或者完全失活的状态下，蒜氨酸的分解转化依然可以进行[2- 3]；
蒜氨酸药代动力学研究和细菌酶分解蒜氨酸研究，表明蒜氨酸受代谢酶分解产物也是大蒜素[4- 5]。

在以蒜氨酸加蒜酶的方式进行药理研究时，发现在抗菌或抗肿瘤作用效果，都是以大蒜素最好，蒜氨酸加蒜酶次之，单独蒜氨酸较差或没有效果[52]。蒜氨酸注射液治疗脓肿模型家兔，发现当蒜氨酸使用剂量超过2.5 mg/kg体质量时，其杀菌作用可与使用剂量4×104U/kg体质量的青霉素媲美，体外蒜氨酸没有杀菌活性，显示了蒜氨酸在体内分解成大蒜素发挥杀菌作用效果；
蒜氨酸使用剂量为0.25 mg/kg体质量治疗家兔脓肿，杀菌力降低，但是治疗一周后所有家兔也完全康复，这是由于蒜氨酸和大蒜素均具有良好的调节机体免疫功能的效果[51]。肿瘤的发生，致病原因和机制多种多样，但是肿瘤抗原逃逸机体免疫监视功能是所有肿瘤发生发展都必须经过的一道屏障，否则肿瘤细胞将被机体免疫功能清除。蒜氨酸能否提高或恢复肿瘤患者的免疫监视功能，有待进一步研究证实；
同时大蒜素具有较好的抗肿瘤作用[55- 59]，且对正常组织细胞无毒副作用；
蒜氨酸注射进入机体后的抗肿瘤效应更加值得进一步探索与研究，将对肿瘤的治疗进入新时代具有重要意义。

综上所述，蒜氨酸分离提取醇沉淀法能沉淀较多的物质成分，存在严重不足，必须与超滤、蒜氨酸等电点相结合方能使蒜氨酸的纯度有一定提高。柱层析法是将分离提取的蒜氨酸溶液进行纯化的方法，更不适于蒜氨酸规模生产所用。透析酸沉淀法使结合蒜氨酸分解成游离蒜氨酸，致蒜氨酸的提取率得到极大提高；
精确滴定蒜氨酸等电点沉淀分离蒜氨酸，蒜氨酸的纯度得到有效提高。同时透析酸法操作简便，流程少，生产不受器材限制而进行规模生产。由此可见透析酸沉淀法是目前较为优越的蒜氨酸分离提取方法。

蒜氨酸口服液是以蒜氨酸命名的保健食品并非药品，蒜氨酸含量极低。蒜氨酸、蒜酶双层包芯片设计原理受蒜氨酸必须在蒜酶蒜氨酸裂解为大蒜素影响，以致应用受限。蒜氨酸微丸附加试剂较多，导致蒜氨酸成为制剂中的微量元素。蒜氨酸注射液无任何添加剂，为蒜氨酸纯品制剂，可大剂量通过静脉注射进入机体，无毒副作用，能极大提高体内蒜氨酸与大蒜素药物浓度，达到预期药理作用效果，更适用于临床。

蒜氨酸能与大分子蛋白非特异结合，具有抑菌、抗氧化、调节免疫功能、在体内分解形成大蒜素等多种生物活性。使用蒜氨酸进行抗感染治疗，显示了蒜氨酸抗病原微生物和免疫调节的双重作用的优越性。蒜氨酸治疗新冠肺炎进行了研究，表现出对新冠肺炎的预防和治疗的积极作用，显示了蒜氨酸抗病毒感染的积极作用[32]。蒜氨酸在体内分解形成大蒜素，共同发挥良好的抗感染、抗肿瘤、抗氧化、调节机体免疫功能、降脂降糖、防治心血管疾病和抗衰老等临床疗效。特别是蒜氨酸的抗肿瘤作用，蒜氨酸在体内分解成大蒜素，大蒜素具有抑制肿瘤细胞的生长，对正常细胞无毒性作用；
同时蒜氨酸与大蒜素均可调节机体免疫功能，恢复机体强大的免疫监视功能，发挥机体自身的抗肿瘤效应。探索蒜氨酸注射液用于肿瘤治疗，将对肿瘤治疗的理论基础、临床疗效均产生深远的影响。