Time-lapse技术联合一步法培养对胚胎发育及妊娠结局的影响

朱霞，邹薇，李慧珍，吴卫丰，马明男，马天仲*

(1.广东医科大学附属医院生殖中心，湛江 524001；
2.广东医科大学第一临床医学院，湛江 524001)

据全球人口统计调查，估计21世纪受不孕症影响的有1.86亿人，约占8%～12%，男女比例持平，大多数是在发展中国家；
在我国，不孕率占25%，且总体发病率仍在上升[1-2]。越来越多育龄期妇女需要通过辅助生殖技术(ART)才能获得妊娠。国内生殖中心通过选择移植2枚或以上胚胎，来提高单次移植的成功妊娠率，这导致了多胎妊娠率居高不下，是目前ART中最常见的并发症之一，也导致妊娠期间并发症随之升高。针对不孕患者挑选优质胚胎、提高临床妊娠率、减少多胎并发症是目前生殖医生面临的难题。时差成像(time-lapse imaging TLI)系统作为一种新型胚胎培养及检测系统，与常规低氧胚胎培养箱相比，TLI培养箱一步法培养能避免胚胎被多次移出培养箱观察，不仅能为胚胎发育提供稳定安全的培养环境，还可以获得更多的胚胎动力学参数，能动态评估胚胎发育潜能[3-4]。有研究表明胚胎形态学评分结合胚胎动力学参数可以挑选最优发育的胚胎进行移植，提高种植率从而改善妊娠结局[5]。本研究旨在分析TLI培养方式和常规低氧培养方式对胚胎培养及临床妊娠结局的影响，探讨TLI培养箱是否有利于挑选高潜能胚胎，为TLI技术的实际应用提供参考信息。

一、研究对象

回顾性分析2020年12月至2022年5月在广东医科大学附属医院生殖中心接受体外受精或卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治疗的年轻患者临床资料。

纳入标准：(1)首次促排卵行IVF/ICSI-ET助孕；
(2)20≤年龄≤35岁；
(3)获卵数≥5个；
(4)资料周期完整。

排除标准：(1)子宫畸形、双子宫和双阴道者；
(2)移植日内膜<7 mm，宫腔积液者；
(3)夫妻任一方存在染色体异常者；
(4)无可移植胚胎者。

本研究共纳入571名患者，按胚胎培养方式不同，分为TLI组(n=254)和常规低氧培养箱组(n=317)两组。根据胚胎移植类型分为D3卵裂期胚胎移植组(TLI组127例，常规培养组127例)和D5囊胚移植组(TLI组99例，常规培养组143例)。入选研究对象包含处于妊娠状态的患者。

二、研究方法

1.促排卵及取卵：根据患者情况制定个性化治疗方案，结合B超及激素水平检测卵泡生长情况，待至少2个卵泡直径≥18 mm或3个卵泡直径≥17 mm时，立即肌肉注射HCG 5 000～10 000 U(珠海丽珠)或艾泽250 μg(默克，德国)进行扳机，35～37 h后在B超引导下经阴道穿刺取卵。

2.受精、胚胎培养：男方禁欲3～7 d，于取卵当日通过手淫取精。根据患者个人情况行IVF/ICSI助孕。常规低氧组行序贯法培养：正常受精卵第1天转移至G-1TMPLUS卵裂培养滴(Vitrolife，瑞典)并置于COOK(K-MINC-100，COOK，澳大利亚)台式培养箱中37℃、6%CO2、5%O2条件下培养至第3天，放置入G-2TMPLUS囊胚培养液(Vitrolife，瑞典)培养至第6天。TLI组行一步法培养：将正常受精胚胎转移至G-TL培养液(Vitrolife，瑞典)并置于ESD(EmbryoScope Version D，Vitrolife，丹麦)培养箱内37℃、6%CO2、5%O2条件下培养至第6天。

3.胚胎质量评估：常规组胚胎体外培养根据细胞数目、卵裂球的形态、均一度及碎片进行评分，优质胚胎参照胚胎实验室关键指标质控专家共识[6]。TLI组培养每10 min拍摄一次结合KIDscore分析胚胎发育的每个阶段时间和形态学对胚胎评分，胚胎形态学根据伊斯坦布尔共识[6]及Gardner囊胚评分标准[7]对胚胎质量评估；
可利用胚胎和优质胚胎指标参照胚胎实验室关键指标质控专家共识[8]。

4.胚胎移植：新鲜胚胎移植者在取卵后选择第3天移植1～2枚卵裂期胚胎或第5天移植1～2枚囊胚。冻融胚胎移植者择期移植1～2枚卵裂期胚胎或移植1～2枚囊胚。新鲜周期和冷冻周期移植后均给予常规黄体支持(达芙通，雅培，荷兰；
或雪诺酮，默克，德国；
或黄体酮针剂，浙江仙琚)。

5.随访：移植14 d/12 d(卵裂期/囊胚)后查血清β-HCG，若β-HCG>5 U/L则为HCG阳性，移植后4～6周行阴道B超，发现孕囊、胎心确认临床妊娠。

6.观察指标：(1)患者的一般资料；
(2)胚胎培养情况，主要有优胚率、囊胚形成率、卵裂胚胎利用率；
(3)妊娠结局，包括临床妊娠率和种植率。优胚率=优质胚胎数/正常受精卵裂数；
囊胚形成率=囊胚形成数/培养囊胚数；
卵裂胚胎利用率=可用卵裂胚胎数/培养卵裂胚胎总数；
临床妊娠率=临床妊娠患者数/移植周期数，种植率=着床胚胎数/移植胚胎数。

三、统计学分析

一、患者一般资料

共纳入571例患者，其中TLI系统培养组(TLI组)254例，常规培养组(常规组)317例。两组患者间年龄、不孕年限、不孕类型、受精方式、抗苗勒管激素(AMH)水平、体质量指数(BMI)、Gn总量、获卵数以及基础性激素(FSH、E2、LH)水平的差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般资料比较[(-±s)，n(%)]

续表

二、两组患者的胚胎培养情况

常规组的2PN卵裂数、优胚率、成熟卵母细胞率、总受精率均高于TLI组(P<0.05)，两组患者优胚数、囊胚数、MⅡ卵母细胞数、受精总数、2PN数、卵裂总数、囊胚形成率、2PN率、2PN卵裂率以及卵裂胚胎利用率的差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者胚胎培养结局比较[M(P25，P75)，%]

三、两组患者胚胎移植的妊娠结局

根据胚胎移植类型的不同，将患者分为D3卵裂期胚胎移植组和D5囊胚移植组，分别统计不同胚胎移植类型下两种胚胎培养模式的妊娠结局差异。

1.D3卵裂期胚胎移植时两组患者的妊娠结局：D3卵裂期胚胎移植包括TLI组127例和常规组127例。统计结果显示，常规组的移植胚胎数显著高于TLI组(P<0.05)；
两组患者间的胚胎着床数、胚胎种植率、HCG阳性率、临床妊娠率及双胎率均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 两组患者D3胚胎移植妊娠结局比较[(-±s)，%]

D3卵裂期胚胎移植时，本中心会移植1～2枚胚胎，根据移植胚胎数又做进一步的分析，分别对移植1枚和移植2枚的患者进行了比较。在D3卵裂期移植1枚胚胎时，TLI组的着床数及种植率虽然均高于常规组，但差异尚无统计学意义(P>0.05)(表4)。D3卵裂期移植2枚胚胎时，TLI组的种植率显著低于常规组(P<0.05)；
两组间胚胎着床数、临床妊娠率及双胎率均无显著性差异(P>0.05)(表5)。

2．D5囊胚移植时两组患者的妊娠结局：D5囊胚移植包括TLI组99例和常规组143例。虽然两组患者间胚胎着床数、种植率、临床妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)，TLI组的临床妊娠率稍高于常规组(表6)。

表4 D3卵裂期移植1枚胚胎时两组患者的妊娠结局比较[(-±s)，%]

表5 D3卵裂期移植2枚胚胎时两组患者的妊娠结局比较[(-±s)，%]

表6 两组患者D5囊胚移植妊娠结局比较[(-±s)，%]

TLI技术主要是对胚胎的发育过程进行高质量连续的图像采集，采集图片频率为5～10 min，属于一种非侵入性的评估系统。目前TLI作为一种新的医学技术，在IVF-ET中被广泛应用，通过连续性观察胚胎发育情况，有利于早期筛选出最佳胚胎移植，为胚胎学家提供了更多的动态参考指标[1，9]。准确评估和选择优质单胚胎移植，降低多胎妊娠率，已成为辅助生殖领域研究的热点。通过分析胚胎早期动力学参数，可以得出卵裂期胚胎动力学参数预测囊胚形成率及胚胎质量[10]，也可预测胚胎染色体整倍性的潜力。整倍体囊胚的发育速度比非整倍体囊胚更快，在移植的整倍体囊胚中的种植胚胎和非种植胚胎间也有差异[11]。TLI技术结合KIDscore评分，发现4细胞分裂的对称性与胚胎非整倍性有关，对于预测非整倍性胚胎有一定的参考价值[12]。TLI技术联合卵丘细胞RNA测序可以更准确的评估胚胎，提高ART的妊娠率[13]，并为以后研究提供方向。许多生殖中心通过TLI技术的胚胎动力参数和形态学构建预测模型对胚胎评分，结合KIDscore预测囊胚移植后的种植率和活产率，发现构建的模型与结果成正相关[14]，可提高卵母细胞利用率并快速高效选择胚胎。但是该技术的安全性也受到广泛关注，相比常规组，TLI组的应用是否确定能提高胚胎种植率、改善妊娠结局，尚存在争议。

王世凯等[15]研究发现TLI组的2PN受精率(71.44%vs. 64.07%)及优胚率(45.21%vs. 41.92%)显著高于常规组(P<0.05)，但总卵裂率、2PN卵裂率、可用胚胎率、囊胚形成率及优质囊胚率等指标比较均无统计学差异。也有研究发现，TLI组D6优质胚胎数[(0.30±0.61) vs.(0.66±1.01)、临床妊娠率(49.18% vs.70.42%)和活产率(45.90% vs. 64.79%)均显著少于常规组(P<0.05)，但两者新鲜移植和冷冻移植的临床妊娠率和活产率差异无统计学意义[16]。Wu等[17]的一项前瞻性随机试验发现，TLI选择的D3优质胚胎数显著低于常规组[(55.8±6.4)% vs.(81.2±4.1)%，P=0.000 5]。本研究中，常规组胚胎的2PN卵裂数、优胚率、卵子成熟率、总受精率均高于TLI培养组(P<0.05)，这与Wu等[17]的研究结果相似，但两组胚胎的优胚数及囊胚数差异无统计学意义。TLI培养箱需要专用培养皿，配置微滴皿比较繁琐，耗时较长，部分型号的专业皿，加盖培养用油容量受限(EDS为1.4 ml)，可能不利于胚胎渗透压的维持，这可能是导致TLI培养法胚胎的部分数据没有常规组好的原因之一。

Kalleas等[18]研究发现，与常规培养组相比，使用TLI培养箱的患者活产率更高(43.2% vs. 34.5%)[OR=1.43，95%CI(0.96，2.13)]，早期流产率显著降低(5.8% vs. 13.8%)[OR=0.37，95%CI(0.19，0.74)]。也有研究表明新鲜胚胎移植中TLI组比常规组有更高的临床妊娠率和着床率(P<0.05)，但两组新生儿结局无显著差异[19]。Meng等[16]研究发现，对于年轻且具有良好卵巢储备功能的妇女在移植1枚卵裂期胚胎时，常规组的临床妊娠率和活产率与TLI组无统计学差异(P>0.05)。Mascarenhas等[20]纳入了1 882个ART周期，与常规培养组相比，TLI组新鲜移植的活产率更高(36.8% vs. 33.9%，P<0.05)，而冷冻胚胎移植中两组活产率无显著差异。本研究中患者行D3卵裂期移植时，常规组的移植胚胎数显著高于TLI组(P<0.05)，而在进一步根据移植胚胎数分为两个亚组比较时，两组间移植1枚D3卵裂期胚胎的着床数及种植率差异虽均无统计学意义(P>0.05)，但是均高于常规组；
移植2枚D3卵裂期胚胎的常规组种植率显著高于TLI组(P<0.05)。

我中心胚胎学家为了降低双胎率，会根据TLI的动力学参数选择搭配不同评分的胚胎来选择移植的胚胎，这可能是TLI组移植双胚胎时没有常规组种植率高的原因之一。两组双胎率比较虽无统计学差异，但可以看出常规组高于TLI组。

高洋等[21]研究表明，TLI组采用形态学评分结合胚胎动态发育参数选择的囊胚移植的临床妊娠率(78.32% vs. 68.66%)和着床率(65.63% vs. 54.83%)均显著高于常规组(P<0.05)，两组的流产率比较无显著性差异(P>0.05)。他们采用的培养法分两步，胚胎培养至D3暂停图像，给胚胎换液后继续放入培养箱。本研究中心胚胎培养至D3时无需更换培养液，减少了换液的干扰，对后期培养囊胚所需环境更稳定。TLI技术弥补了仅通过胚胎形态学评估胚胎的发育的状态，通过TLI技术可以挑选发育速度较快的胚胎移植获得可观的妊娠结局[22]，继而发挥临床应用价值。本研究中D5囊胚移植时，两组间着床数、种植率、临床妊娠率虽无统计学差异，但TLI组都高于常规组。选择囊胚移植的患者可以获得较好的临床妊娠率。

本研究表明无论移植1枚D3卵裂期胚胎还是D5囊胚胚胎，TLI组的着床数及种植率均高于常规组，进一步说明TLI培养可以改善妊娠结局，减少多胎妊娠的并发症。也有荟萃分析发现，没有明确证据表明TLI组和常规培养组在持续妊娠率、临床妊娠率、着床率上存在统计学差异[23]。

综上所述，针对年轻不孕的妇女，选择TLI培养可以提高临床妊娠率，降低多胎率。目前常规培养方式由于其经济、简便，是目前大多数中心的常用培养方法。而TLI技术联合一步法培养，能挑选出最有潜力着床的胚胎，有效降低多胎率，提高妊娠率，是未来生殖中心发展的方向。然而，本研究样本量较小，为单中心数据，且大多数患者处于妊娠状态，未进一步分析新生儿结局，TLI技术对子代健康是否有影响仍需要进行多中心大样本的临床研究，进一步证实TLI培养的安全有效性。