2株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

秦义娴，陈晓春，刘 丹，孙 淼，薛青红，吴华伟，高金源，高月异

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，是有囊膜的单股正链RNA分子，全长约12.3 kb。基因组只含有一个开放阅读框(ORF)，两端为非编码区(5′和3′UTR)，编码1个大的多聚蛋白，在病毒蛋白酶和宿主细胞酶的作用下加工形成4种结构蛋白(核衣壳蛋白C及3种包膜糖蛋白Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白。根据5′-UTR、Npro和E2基因序列可将BVDV分为BVDV-1、BVDV-2两种基因型，BVDV-1进一步又可分成至少22个基因亚型(1a～1v)。从我国国内各地报道的BVDV感染情况来看，同时存在BVDV-1型和BVDV-2型，且BVDV-1型多于BVDV-2型[1]。2004年欧洲学者从巴西进口的一批胎牛血清中分离到瘟病毒“Hobi”株，随后又陆续从胎牛血清和细胞系中分离到类似毒株，将其归类为BVDV-3型[2]。根据是否可在细胞上引起病变，将BVDV分为两种生物型，分别为致细胞病变型(CP)和非致细胞病变型(NCP)，BVDV-1型、BVDV-2型和BVDV-3型均同时存在两种生物型[3]。

目前，关于BVDV的研究主要集中在结构蛋白，其中E2蛋白编码区是BVDV基因组内变异性最高的区域之一，其高变异性可影响BVDV的诊断，并可能导致已有疫苗的免疫失败，因此E2蛋白成为目前研究最多的结构蛋白。本研究对新疆、河南两省的2头疑似BVDV感染的牛血清样本进行BVDV的分离鉴定，成功分离到2株BVDV毒株，利用生物学软件DNA Star对2个毒株的E2基因序列进行比对及遗传进化分析，为该病的分子流行病学调查及防控提供了数据支持。

1.1 材料

1.1.1 样品及细胞 样品为新疆和河南2头初筛为BVDV核酸阳性的牛血清，由中国兽医药品监察所保存；
MDBK细胞，由中国兽医药品监察所保存。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒，北京天根生物公司产品；
KOD酶高保真PCR试剂盒、反转录试剂盒、DNA Marker，TaKaRa公司产品；
DNA纯化回收试剂盒，北京百泰克生物技术有限公司产品；
pEasy-Blunt Simple Cloning Kit，北京全式金公司产品；
FITC标记的山羊抗小鼠抗体，Sigma公司产品；
BVDV-1型单克隆抗体，由中国兽医监察所保存。

1.1.3 主要仪器设备 倒置显微镜、荧光显微镜，Nikon公司产品；
CO2培养箱，Memmert公司产品；
凝胶成像系统，UVITEC公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参照GenBank中发表的BVDV毒株基因序列(表1)，用Primer Primer5.0软件，设计出扩增E2基因全长的引物，上游引物BVDV-E2-F为5′-ACCAGATTGGTGGCCTTA-3′，下游引物BVDV-E2-R为5′-CAAGTTGCCCATCATCAT-3′，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司(后简称华大基因)合成。预期扩增片段大小为1 375 bp。

1.2.2E2基因的扩增 按照RNA提取试剂盒说明书提取3份血清样本的总RNA，反转录后，进行E2基因的扩增，PCR扩增反应体系(20 μL)如下：2×PCR buffer for KOD Fx Neo 25 μL，dNTPs 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，KOD Fx Neo 1 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 2 min；
98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35个循环；
68 ℃ 10 min，10 ℃∞。用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增结果。

1.2.3 病毒分离 将血清样本4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，接种长成良好单层的MDBK细胞，37 ℃培养箱内培养120 h，收获细胞培养物并盲传10代，置-40 ℃以下保存备用。

1.2.4 间接免疫荧光检测 将1.2.3收获的病毒液接种已长成良好单层的96孔MDBK细胞培养板，同时设立正常细胞对照，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养，接种后72 h，弃去培养液，用PBS洗2次。每孔加入100 μL 800 mL/L冷丙酮溶液，2 ℃～8 ℃固定30 min，然后弃去丙酮，自然晾干。用PBS洗涤细胞面1次，然后每孔加入用PBS 1∶1 000稀释的BVDV-1型单克隆抗体(一抗)50 μL，37 ℃作用1 h。弃去一抗，用PBS洗2次。弃去洗液，每孔加入用PBS 1∶400稀释的FITC标记的山羊抗小鼠抗体(二抗)50 μL，37 ℃作用1 h。用PBS洗2次后置于荧光显微镜下观察细胞。

表1 参考毒株信息

1.2.5E2基因的克隆及序列分析 将盲传10代的病毒液提取RNA，反转录为cDNA，再以KOD高保真酶进行E2基因的扩增，回收目的片段后与pEasy-Blunt Cloning载体连接，转化入Top10感受态细胞，挑取菌落于2 mL LB培养液中37 ℃振荡培养16 h，进行PCR鉴定，取鉴定正确的菌液送华大基因测序。将测序结果去除附加序列后，用DNA Star软件对扩增的E2基因及GenBank中公布的参考毒株的核苷酸序列进行比较分析，并绘制系统进化树。

2.1 E2基因扩增结果

将2份血清样本提取总RNA后，用BVDV E2特异性引物进行RT-PCR扩增，2个毒株均扩增出1 375 bp大小的片段，与预期的目的片段大小相符(图1)。

M.DNA标准DL 5 000;1.血清样本1；
2.血清样本2

2.2 病毒分离与间接免疫荧光结果

2份血清样本接种MDBK细胞后盲传10代，均未产生特征性细胞病变。但将盲传10代收获的细胞冻融物接种MDBK细胞培养72 h，进行间接免疫荧光检测，可观察到明显荧光(图2)，证明成功分离到2株NCP型BVDV，分别命名为HN和XJ-2。

2.3 E2基因的遗传进化分析

对2株分离毒株E2基因进行测序，结果表明，去除附加序列后，HN株、XJ-2株的E2基因序列长度均为1 119 bp，这与GenBank上公布的BVDV E2序列大小相符合。利用DNA Star软件，将2个分离株与GenBank发表的国际参考毒株和国内流行毒株进行比对分析，并绘制系统发育进化树(图3和图4)。结果显示，HN株与XJ-2株的同源性为99.9%，且2个分离株与BVDV1b亚型的JL-1株处于同一分支，同源性最高，分别为99.3%和99.4%，与同属于BVDV1b亚型的Changchun184株同源性分别为85.8%和85.9%。而HN株与BVDV-2基因型及BVDV-3基因型毒株的同源性仅为59.2%～65.1%，XJ-2株与BVDV-2基因型及BVDV-3基因型毒株的同源性仅为59.3%～65.2%。因此，HN株和XJ-2株均属于BVDV1b亚型。

A.HN株；
B.XJ-2株；
C.MDBK正常细胞对照A.Infected with HN strain;B.Infected with XJ-2 strain；
C.MDBK normal cell control

牛病毒性腹泻自1946年在美国纽约州首次报道以来，目前已存在70余年，每年给养牛业造成的直接和间接经济损失都十分巨大。据统计，世界各国每年每头牛损失0～552美元，平均约46.5美元，而欧洲的经济损失更是高达每头牛87美元[4]。BVDV的宿主范围广泛，除主要感染牛外，还可引起绵羊、山羊、猪、鹿、水牛、野牛、羊驼、骆驼等多种动物的感染[5]。BVDV感染牛后，常导致高热、腹泻、妊娠母牛流产或胎儿畸形、口腔和消化道黏膜糜烂、坏死及血小板和白细胞减少等症状[6]。NCP型与CP型BVDV均能引起被感染动物的急性感染，但主要是由NCP引起[7]，且NCP BVDV能够通过胎盘，常导致持续性感染(PI)牛的出生，而PI牛在整个生存周期可持续排出大量感染性病毒颗粒，是易感动物感染病毒的主要来源。此外，BVDV还可造成牛源生物制品(血清、疫苗等)的污染，是目前非禽源兽用生物疫苗外源病毒检验的必检项目。

图3 2个BVDV分离毒株与参考BVDV毒株E2基因核苷酸同源性分析

图4 BVDV E2基因核苷酸序列的遗传进化树

目前，防控BVDV主要依靠疫苗免疫和清除PI动物，而研制有效的疫苗需充分考虑BVDV的遗传多样性。我国流行的BVDV基因亚型包括1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p、 1q、1u、2a和2b亚型[8-10]，通常认为BVDV1b和1m是我国的优势流行亚型[11]，Deng M等通过对我国19个省份92个奶牛场超过500头牛进行检测，结果表明1a、1c和1m是我国的优势亚型[12]。BVD疫苗包括传统的灭活疫苗及新型基因工程疫苗，目前我国已获批上市的BVD疫苗有牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(1型，NM01株)、牛病毒性腹泻/黏膜病、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(NMG株+LY株)及牛病毒性腹泻/黏膜病、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(1型，NM01株+LN01/08株)。而新型基因工程疫苗尚未获得批准文号，其研究方向主要集中在E2蛋白，一方面因为E2蛋白含有BVDV优势抗原表位，能诱导机体产生中和抗体，参与调节补体系统，使其不能被先天免疫系统所监视和破坏[1]，另一方面，E2蛋白能同E1蛋白一起形成E1-E2异质二聚体，对BVDV吸附和细胞进入起到关键作用[13]。已有的研究表明，根据E2基因序列可将BVDV-1b分为1b1和1b2亚型[14]，且大多数BVDV1b分离株都属于1b1亚型，如Changchun184。本研究从河南、新疆两地成功分离鉴定了2株BVDV1b基因亚型分离株，与BVDV JL-1株的同源性高达99%以上，但与经典的BVDV 1b1 Changchun184株的同源性仅为85.8%～85.9%，为BVDV 1b2亚型。2株BVDV毒株的成功分离鉴定，为了解我国目前BVDV的流行现状及BVDV疫苗及诊断试剂的研制提供数据支持。