养殖池塘黄河鲤肠道硫酸盐还原菌群落特征解析

马丽美，蔡慧敏，梁晓敏，游 富，江爱霞，杨国坤，张新党，常绪路，张艳敏，孟晓林

(河南师范大学水产学院/河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南新乡，453007)

鱼类肠道内存在种类繁多、数量庞大的正常菌群[1]。这些菌群被称为宿主的“第二基因组”[2]，在宿主的营养、消化、免疫方面发挥重要作用[3；
4]。已有研究表明，肠道菌群的平衡与稳定保证了肠道健康，肠道菌群结构改变，特别是关键功能菌的变化，与宿主的健康密切相关[5]。然而，人们对于鱼类肠道菌群的研究主要在微生物的群落组成，以及某一种微生物对肠道微生态的功能或调节作用方面，对具有特定功能的微生物功能群尚缺乏深入的研究。硫酸盐还原菌(sulfate-reduction bacteria，SRB)是一类广泛存在于自然沉积环境、人和动物肠道中的厌氧或兼性厌氧微生物[6]，该类群微生物可在氧化有机质(如乙酸、醋酸)或氢气(H2)时，通过异化作用将硫酸盐或亚硫酸盐还原为硫化氢(H2S)或其它含硫化合物，对生态环境、人和动物肠道微环境的硫(S)元素循环具有重要意义[7]。在系统发育学上，大部分SRB隶属于变形菌门(Proteobacteria)。在人和动物肠道或粪便中，检测到的SRB类群主要为脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫杆菌属(Desulfobacter)、脱硫球茎菌属(Desulfobulbus)和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)，定植部位大多在结肠黏液层[8]。现有的研究证明，SRB在人和动物肠道内普遍存在[9,10]。与肠道中的其它微生物存在着复杂的关系，在肠道微生态平衡的调节方面发挥着重要作用[11]。当肠道稳态失衡时(如免疫力低下、肠道菌群失调)，某些条件致病的SRB可能会大量繁殖产生过量H2S，破坏肠道屏障，造成肠道损伤，引起肠道疾病[12-15]。

SRB的群落结构多通过编码异化亚硫酸盐还原酶关键基因(dsrAB)的检测来完成，该功能基因主要包括dsrA和dsrB两个亚基[16]，其中dsrB基因的扩增是检测SRB群落分布的有效方法[17]。近年来，功能基因高通量测序技术被广泛用于不同环境中SRB群落结构的检测[6]。目前，有关SRB的研究主要集中在自然沉积环境、人类和哺乳动物肠道中，鱼类作为数量最多、分布最广的水生脊椎动物，人们对于其肠道中SRB的群落组成和功能还知之甚少[18]。黄河鲤(CyprinuscarpioL.)属于杂食性底栖鱼类，是中国养殖最广泛的淡水鱼[19]，主要养殖模式是集约化池塘养殖。黄河鲤肠道内的优势种群主要为变形菌门、梭杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等[20-23]，但人们对于黄河鲤肠道内某一功能群的结构和功能还了解甚少[2]。因此，本研究以黄河鲤为研究对象，采用dsrB基因高通量测序技术解析养殖池塘黄河鲤前、中、后肠SRB群落特征，并对该功能群进行FAPROTAX数据库代谢功能预测，探讨养殖池塘黄河鲤肠道SRB群落结构和代谢特征，以期为探究SRB在鱼类肠道微生态平衡方面发挥的作用提供理论依据。

1.1 黄河鲤样品采集

实验黄河鲤采自河南省郑州市荥阳黄河滩养殖池塘。选择养殖面积相似和水环境特征、黄河鲤大小规格相近的3个黄河鲤养殖池塘(A组、B组、C组)作为野外采样池塘。采样时间为2019年8月份。分别从每个养殖池塘中选取规格、遗传背景一致的黄河鲤6尾，以10%的MS-222进行麻醉，鱼体表面以70%酒精进行消毒，无菌环境中分别取前(F)、中(M)、后(H)肠道内容物，其中每2尾鱼的肠道内容物置于1.5 mL无菌离心管中旋涡震荡混匀、分装后立即置于干冰中保存，运回实验室后保存至-80 ℃冰箱至进一步分析。

1.2 黄河鲤肠道内容物总DNA的提取和dsrB功能基因高通量测序

黄河鲤肠道内容物样品总DNA采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒进行提取(Qiagen，Germany)。将合格的DNA样品(>20 ng/μL)送至上海美吉 Illumina HiSeq2500测序平台进行高通量测序。即以总DNA为模板，采用dsrB功能基因引物为DSRp2060F(5′-CAACATCGTYCAYACCCAGGG-3′)和DSR4R(5′-GTGTAGCAGTTACCGCA-3′)。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃延伸5 min。

1.3 生物信息学与统计分析

使用QIIME(Version1.17)对高通量测序所得的原始数据进行去杂、优化，α多样性分析。在97%相似度下，利用UPARSE(7.0.1090)软件进行OTU聚类；
通过RDP classifer(Version 11.5)软件将OTU代表序列与细菌UNITE数据库比对，进行物种注释并统计各样本在各分类水平下的相对丰度和群落组成；
利用Mothur(Version 1.30.2)软件进行α多样性分析；
利用OriginPro 2018C进行韦恩图制作。最后基于FAPROTAX数据库(FAPROTAX 1.1)预测不同样本中SRB的代谢功能。

2.1 黄河鲤肠道dsrB基因序列分析

对黄河鲤前、中、后肠内容物SRB功能群进行dsrB基因扩增和高通量测序，前肠没有扩增出SRB功能群，只有A组后肠，B组中肠、后肠和C组后肠SRB功能群PCR扩增成功，共获得73 613条序列，覆盖率均大于 99.9%，序列长度203～441 bp(平均长度为330 bp)(表1)。

表1 养殖池塘黄河鲤肠道内容物dsrB基因高通量测序序列结果统计

2.2 黄河鲤肠道SRB群落α多样性分析

根据黄河鲤肠道内容物测序结果，以97%相似性水平为标准划分OTU，所有序列被分为173个OTUs，对不同的OTUs进行α多样性分析(ACE、Chao l、Shannon、Simpson指数)结果见表2。从表2中可以看出，在B组中肠样本的Chao 1和ACE指数远大于后肠样本，而中肠样本中的Shannon指数高于各个后肠样本，Simpson指数则与之相反。表明黄河鲤中肠SRB群落丰富度和多样性均高于后肠。

表2 不同组黄河鲤肠道SRB群落α多样性指数分析

黄河鲤中肠、后肠SRB OTU Venn图分析结果显示(图1)，中肠和后肠共有81个OTUs，中肠和后肠特有的OTUs数分别为93和80，表明中、后肠SRB功能群的分布具有一定的空间特异性。

图1 黄河鲤中肠(M)和后肠(H)中SRB OTUs分布Venn图

2.3 黄河鲤肠道SRB群落结构分析

系统发育学分析结果显示，在门水平上，黄河鲤中、后肠SRB大部分为未知分类单元(相对丰度分别为82.44%和84.1%)，表明黄河鲤肠道中SRB群落大多数分类单元还未确定。在已知的分类单元中，中、后肠SRB优势类群均为变形菌门(相对丰度分别为16.52%和15.9%)。其中，中肠SRB优势类群还包括厚壁菌门(相对丰度0.5%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(相对丰度0.48%)和绿弯菌门(Chloroflexi)(相对丰度0.05%)(图2A)。后肠SRB主要包括变形菌门(相对丰度为15.9%)(图2B)。

在属水平上，中肠SRB主要属类是变形菌门的脱硫球茎菌属(相对丰度为15.6%)、脱硫弧菌属(相对丰度为0.53%)、互营杆菌属(Syntrophobacter属)(相对丰度为0.40%)，厚壁菌门的脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)(0.50%)和绿弯菌门的暖绳菌属(Caldilinea)(相对丰度0.05%)(图2C)。后肠SRB主要类群是变形菌门的脱硫球茎菌属(相对丰度为12.59%)、脱硫弧菌属(相对丰度为1.67%)、脱硫菌属(Desulfotalea)(相对丰度为0.71%)、互营杆菌属(相对丰度为0.51%)、脱硫念珠菌属(Desulfomonile)(相对丰度为0.38%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(相对丰度为0.04%)(图2D)。

图2 养殖池塘黄河鲤肠道SRB在门(A，B)和属(C，D)水平的群落结构特征

2.4 黄河鲤肠道中、后肠SRB群落功能预测

对黄河鲤肠道SRB群落FAPROTAX功能预测结果发现，预测到的代谢途径主要包括硫化合物的呼吸作用、硫酸盐呼吸作用和化能异养，表明黄河鲤肠道SRB群落主要参与肠道内的硫元素循环和化能异养等代谢途径(图3)。

图3 黄河鲤中、后肠SRB群落FAPROTAX功能预测热图

其中，在A组黄河鲤后肠(A-H)、B组黄河鲤中肠(B-M)、B组黄河鲤后肠(B-H)和C组黄河鲤后肠(C-H)SRB代谢途径中，硫化合物的呼吸作用、硫酸盐呼吸作用和化能异养的相对丰度比较高，好氧化能异养的相对丰度较低。其中，B组黄河鲤后肠的好氧化能异养的相对丰度与其他相比略高。从整体上来看，与后肠相比，黄河鲤中肠被检测出来的SRB代谢途径的丰度较低。

3.1 黄河鲤肠道SRB功能群的分布特征

本研究采用dsrB基因高通量测序技术分析了黄河鲤肠道中的SRB群落结构特征，结果发现SRB在黄河鲤肠道中主要分布在中、后肠，且中肠SRB多样性明显高于后肠(α多样性分析)。同时，α多样性分析结果显示黄河鲤中、后肠的SRB群落分布存在一定的空间异质性，即黄河鲤中、后肠SRB群落共有OTU有81个，特有的OTU分别有93、80个。这与已有研究中，鱼类肠道微生物的总体分布具有空间异质性的结果一致[24]。同样的，在人和哺乳动物肠道中，也发现有SRB群落。RAN等[6]发现仔猪肠道SRB主要分布在其盲肠。人类肠道的SRB群落主要分布在结肠[15]。SRB在鱼类和其它物种肠道内的分布存在空间异质性的可能原因是中、后肠的微氧和厌氧环境更有利于SRB的生长。并且，有研究发现，猪肠道SRB的群落组成与猪年龄等有关，但肠道脱硫弧菌是仔猪肠道中的主要的SRB[6]。在本研究中，仅在B组黄河鲤中肠，A、B、C组后肠检测到SRB，这种差异是否与鱼类个体间差异、养殖池塘的水体环境差异等影响因素有关，还需要进一步的实验来证实。

进一步的系统发育学分析表明，黄河鲤肠道中SRB功能群中丰度最高的是变形菌门，也是黄河鲤肠道菌群中的优势类群[25，26]。在属水平上，黄河鲤中、后肠中的已知优势属为脱硫球茎菌属。RAN等[6]在猪肠道中检测的SRB菌群在门水平上主要分布在变形菌门，但是在属水平上，脱硫弧菌属为优势种群，并指出该类群在猪肠道中正常发挥硫循环功能，可以及时清除肠道中的氢气(H2)，保持肠道健康。本研究发现，在健康黄河鲤肠道中发现SRB功能群中丰度最高的是脱硫球茎菌属，这可能是物种或环境差异造成的。KUSHKEVYCH等[27]在人类肠道中，发现脱硫弧菌属和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)，并且脱硫弧菌属是炎症性肠病患者粪便中最常见的SRB。在人类肠道中，SRB群落的脱硫弧菌属含量最多，已有研究发现，这类SRB的增殖可以使硫化氢积累，导致溃疡性结肠炎[15]。另外，有研究发现，脱硫弧菌属在表现糖耐量异常的小鼠肠道中含量增加。殷晓晨等[28]发现在肥胖症患者膳食干预减肥过程中，随着患者体重的减轻，其肠道内脱硫弧菌减少。这表明硫酸盐还原菌可能与代谢综合征相关。在本研究中，健康黄河鲤肠道中也发现了SRB群落的脱硫弧菌属，但是关于脱硫弧菌属的过量繁殖是否会导致鱼类肠炎，对鱼类代谢是否有影响，还需要进一步实验进行验证。

目前，在动物和人类的胃肠道中检测到的SRB，除了脱硫弧菌属最为丰富外，同时也存在脱硫杆菌属、脱硫球茎菌属和脱硫肠状菌属等分类单元，这些类群也是黄河鲤肠道中丰度较高的类群[29]。本研究发现，在健康黄河鲤肠道SRB群落中还存在脱亚硫酸菌属、脱硫菌属、脱硫念珠菌属、互营杆菌属等特有类群。另外，在人类肠道中也存在黄河鲤肠道内没有检测出来的SRB群落，例如，脱亚硫酸菌属、脱硫杆菌属和脱硫单胞菌属(Desulfomonas)等[30]。然而，有关鱼类与哺乳动物肠道中SRB群落结构和功能差异的原因还有待进一步的探讨。

3.2 黄河鲤肠道SRB的主要代谢功能

基于FAPROTAX数据库功能注释结果，本研究发现，黄河鲤肠道SRB参与的代谢过程主要包括硫化合物的呼吸作用、硫酸盐呼吸作用和化能异养，说明黄河鲤肠道SRB细菌群落相对丰度主要集中在硫化物代谢和化能异养功能上。

PITCHER等[31]表示人类肠道中的SRB(脱硫弧菌属)主要与硫化物毒性有关，参与人体肠道硫代谢，可以通过硫酸盐还原和含硫氨基酸的代谢引起溃疡性结肠炎。肠道中的SRB代谢与仔猪肠道中的其它菌群有着交叉喂养关系，共同影响着仔猪肠道中的硫代谢[6]。HOPKINS等[32]推测含有大量双歧杆菌(Bifidobacterium)的婴儿微生物群中存在脱硫弧菌属，这可能是因为大量乳酸与氢气(H2)是肠道中SRB的重要电子供体，即人类肠道中SRB(脱硫弧菌属)参与了诸多的化能异养或自养过程，即该结果与本研究中黄河鲤肠道SRB功能预测的结果相似，SRB不仅主要参与黄河鲤肠道中S元素的循环过程，还与其它类群的微生物存在复杂的交叉喂养关系，参与化能异养过程。

通过SRB功能基因(dsrB)高通量测序技术，对黄河鲤前、中和后肠SRB功能群进行检测，发现SRB功能群在黄河鲤肠道中主要分布在中肠和后肠，中肠的SRB主要包括变形菌门的脱硫球茎菌属、脱硫弧菌属、互营杆菌属，厚壁菌门的脱亚硫酸菌属和绿弯菌门的暖绳菌属；
后肠的SRB主要分布在变形菌门的脱硫球茎菌属、脱硫弧菌属、脱硫菌属、互营杆菌属、脱硫念珠菌属和鞘氨醇单胞菌属。且变形菌门的脱硫球茎菌属是黄河鲤肠道中SRB功能菌群中的优势菌群。对黄河鲤肠道SRB群落FAPROTAX数据库功能预测结果发现，黄河鲤肠道SRB参与的代谢过程主要包括硫化合物的呼吸作用、硫酸盐呼吸作用和化能异养。