梭果黄芪、云南黄芪对血栓形成的影响

付 姿 郭羽 伍蓉霜王金达沈磊∗

［1.大理大学药物研究所， 云南 大理671000；

2.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室（培育）， 云南 大理671000；

3.大理大学药学院， 云南 大理671000］

血栓是高致死性缺血性心血管病的元凶，而目前用于防止血栓性疾病的药物均有增加出血风险、作用靶点单一导致耐受性等缺点［1］，寻找出血副作用少的多靶点抗血栓药物仍有必要。理气活血的中药被广泛应用于血栓性疾病（即血瘀证）的治疗，具有高效低毒和多靶点抗血栓的优点［2］。中药黄芪以补气虚为主，有治疗血瘀证的理论基础，并在多个研究中显示出一定的抗血栓活性，如抑制胶原蛋白⁃肾上腺素诱导的体内血栓和体外血栓形成［3］，减少静脉血栓形成［4］，抑制血小板聚集［5］等。同时，黄芪也是抗血小板组方中的重要成分之一［6］。

正品黄芪包括膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.和蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao，主要生长于东北、华北和西北的高纬度地区。云南无正品黄芪分布，但是由于环境的多样性，有很多黄芪属植物分布。绝大部分云南黄芪属植物生长于滇西北的高海拔地区，属于特殊生态环境植物，具有普通生态环境植物所不具备的特点和利用价值。课题组前期对云南黄芪属植物的化学成分进行了广泛研究［7⁃9］，并初步探讨了某些植物的抗血小板活性。研究发现，与正品黄芪成分高度类似的梭果黄芪Astragalus ernestiiComber 和与正品黄芪成分区别很大的云南黄芪Astragalus yunnanensisFranch 均能抑制血小板聚集，但作用途径差别较大［10］。由于血小板活化在血栓形成中扮演主要角色［11］，本研究计划进一步研究这2 种云南属植物的抗血栓活性，并评价其出血风险，为初步了解云南黄芪属植物在心血管疾病中的应用价值提供数据支持。

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量180～200 g；
SPF 级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量20～24 g，均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2019⁃0004。

1.2 试剂与药物 正品黄芪购自大理下关万花路健之佳药店，产地甘肃，批号20 180102；
云南黄芪、梭果黄芪均采自香格里拉，经大理大学张德全教授鉴定为云南黄芪Astragalus yunnanensisFranch、梭果黄芪Astragalus ernestiiComber。水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号Q／12HB4218⁃2017）；
阿司匹林（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号H172201）；
注射用尿激酶（南京南大药业有限责任公司，批号20200801）；
血栓素B2（TXB2）试剂盒、6⁃酮⁃前列腺素F1α（6⁃K⁃PGF1α）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20210108）；
含129 mmol／L 枸橼酸钠采血管、不含抗凝剂采血管（成都瑞琦医疗科技有限责任公司，批号20201024、20201508）。

1.3 仪器 0408⁃2 型台式低速离心机 ［上海医疗器械（集团）有限公司］；
恒温水浴锅（金坛市环保仪器厂）；
Varioskan LUX 型功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）。

2.1 提取物制备 将正品黄芪、云南黄芪、梭果黄芪的干燥根分别粉碎成粗粉，依次用75%乙醇提取1 h，95%乙醇提取2 h，95%乙醇再提取2 h，提取液减压浓缩后得到浸膏，经冷冻干燥后得到冻干粉，实验时用生理盐水稀释至相应质量浓度。在体内、体外血栓形成实验和出血实验中，上述3 种提取物的剂量均根据预实验结果确定。

2.2 体外血栓形成实验 大鼠随机分为阴性对照组，正品黄芪7.5、15、30 mg／mL组，云南黄芪7.5、15、30 mg／mL组，梭果黄芪7.5、15、30 mg／mL组，阳性对照组（250 U／mL尿激酶），腹主动脉插管取血至采血管中，在37 ℃下放置5 h 使血液凝固，取出血凝块，放入生理盐水中清洗至无明显血水后，切成质量约为100 mg 的小段，置于含不同质量浓度相应药物的1.5 mL EP 管中，在37 ℃下孵育24 h，阴性对照组放入生理盐水孵育，最后取出并称定剩余血凝块质量，计算血栓溶解率，公式为血栓溶解率＝［（给药前血栓湿质量－给药后血栓湿质量）／给药前血栓湿质量］ ×100%。

2.3 体内血栓形成实验 大鼠随机分为假手术组，模型组，正品黄芪150、300 mg／kg组，云南黄芪150、300 mg／kg组，梭果黄芪150、300 mg／kg组，阳性对照组（阿司匹林100 mg／kg），给药组灌胃给予不同剂量相应药物，阴性对照组和模型组均灌胃给予生理盐水10 mL／kg，每天1次，连续7 d。采用FeCl3诱导颈总动脉血栓形成法造模，末次给药30 min后，腹腔注射4 mL／kg 10%水合氯醛麻醉大鼠，分离左侧颈总动脉置于封口胶条（3 cm×1.5 cm）上，20%FeCl3溶液浸透的滤纸条（1 cm×1 cm）环敷颈总动脉，滤纸接口处用血管夹轻夹确保滤纸紧贴，假手术组用生理盐水代替FeCl3进行环敷，20 min 后取掉滤纸，生理盐水冲洗3次，40 min 后腹主动脉取血，置于含129 mmol／L 枸椽酸钠的采血管中，4 ℃、3 000 r／min 离心10 min，分离血浆，用于检测血浆血栓素B2（TXB2）、6⁃酮⁃前列腺素F1α（6⁃K⁃PGF1α）水平。取血后，精确剪下1 cm 被滤纸条包裹过的颈总动脉血栓部位血管段，置于滤纸上吸干浮血，称定含血栓的血管湿质量，取出血栓后再称定质量，两者相减，即得血管段内血栓的湿质量。

2.4 出血实验 小鼠随机分为阴性对照组，正品黄芪300、600 mg／kg组，云南黄芪300、600 mg／kg组，梭果黄芪300、600 mg／kg 组、阳性对照组（阿司匹林200 mg／kg），灌胃给予不同剂量相应药物（阴性对照组灌胃给予20 mL／kg 生理盐水），每天1次，连续4 d。采用切尾法测定尾出血时间，末次给药1 h 后固定小鼠，距尾尖3 mm 处剪断鼠尾，立即浸入37 ℃生理盐水中，记录从剪去尾尖到血流停止的时间，即为尾出血时间。

2.5 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间总体差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3.1 各品种黄芪对体外血栓形成的影响 与阴性对照组比较，尿激酶组，正品黄芪15 mg／mL组，云南黄芪15、30 mg／mL组，梭果黄芪15、30 mg／mL 组均能增加血栓溶解率（P＜0.05，P＜0.01），其中剂量为30 mg／mL 时溶解血栓的能力依次为云南黄芪＞梭果黄芪＞正品黄芪，15 mg／mL时依次为梭果黄芪＞云南黄芪＞正品黄芪，7.5 mg／mL时均不能增加血栓溶解率（P＞0.05），但各剂量下的作用均弱于尿激酶，见表1。

表1 各品种黄芪对体外血栓形成的影响（，n＝6）

表1 各品种黄芪对体外血栓形成的影响（，n＝6）

注：与阴性对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；
与正品黄芪组（30 mg／mL）比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 各品种黄芪对体内血栓形成的影响 与模型组比较，阿司匹林组，正品黄芪300 mg／kg组，云南黄芪150、300 mg／kg组，梭果黄芪150、300 mg／kg 组均能减少血栓湿质量（P＜0.05，P＜0.01），其中剂量为300 mg／kg 时溶解体内血栓的能力依次为梭果黄芪＞正品黄芪＞云南黄芪，150 mg／kg时依次为梭果黄芪＞云南黄芪＞正品黄芪，并且梭果黄芪上述作用与阿司匹林相当。与模型组比较，阿司匹林组，正品黄芪150、300 mg／kg组，云南黄芪150 mg／kg组，梭果黄芪150、300 mg／kg 组均能降低TXB2水平（P＜0.05，P＜0.01），而云南黄芪150、300 mg／kg组，梭果黄芪150 mg／kg 组均能升高6⁃K⁃PGF1α 水平（P＜0.05，P＜0.01）；
与假手术组比较，模型组TXB2／6⁃K⁃PGF1α 升高，而各品种黄芪均能降低该比值（P＜0.05，P＜0.01），作用能力依次为云南黄芪＞梭果黄芪＞正品黄芪，见表2。

表2 各品种黄芪对体内血栓形成的影响（，n＝8）

表2 各品种黄芪对体内血栓形成的影响（，n＝8）

注：与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；
与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；
与正品黄芪组（300 mg／kg）比较，＃P＜0.05。

3.3 各品种黄芪对尾出血时间的影响 与阴性对照组比较，阿司匹林组，正品黄芪300 mg／kg组，梭果黄芪300、600 mg／kg 组均能延长尾出血时间（P＜0.01），而正品黄芪600 mg／kg 组、云南黄芪600 mg／kg 组均对其无明显影响（P＞0.05），各品种黄芪出血风险依次为梭果黄芪＞正品黄芪＞云南黄芪，并且均低于阿司匹林，见表3。

表3 各品种黄芪对尾出血时间的影响（，n＝8）

表3 各品种黄芪对尾出血时间的影响（，n＝8）

注：与阴性对照组比较，∗∗P＜0.01。

特殊生态环境指的是环境条件和生物种类明显不同于普通生态环境的生存环境，如高海拔、寒冷、沙漠等。生长于特殊生态环境中的植物（黄芪、天山雪莲、藏红花等）往往含有特殊使用价值的化学成分。本课题组已对云南黄芪属植物的分布、生药学和化学成分做了系统的研究，发现除了梭果黄芪和黑毛多枝黄芪含有与正品黄芪类似的成分外，其余云南黄芪属植物所含成分均与正品黄芪存在很大的差异性，这可能会带来云南黄芪属植物与正品黄芪在功能上的差异。本研究表明，同等剂量下，云南黄芪和梭果黄芪溶解体外血栓能力强于正品黄芪；
梭果黄芪抑制FeCl3诱导动脉血栓形成的能力最强，而云南黄芪降低TXB2／6⁃K⁃PGF1α 比值的能力最强。这些结果表明2 种云南特殊生态环境的黄芪治疗血栓性疾病的潜力高于正品黄芪。

尽管2 种黄芪均有抗血栓的作用，但是具体作用途径有差别。一定浓度的FeCl3能损伤血管内皮，从而活化体内血小板和凝血系统，形成局部动脉血栓［12］。血小板活化在动脉血栓形成中有及其重要的作用，血栓素A2（TXA2）和前列环素I2（PGI2）均由血小板产生，前者促进血小板聚集和收缩血管，后者抑制血小板聚集和舒张血管，在生理状态下，两者保持动态平衡，而在血栓性疾病（如动脉粥样硬 化、冠心病、高脂血症）中，TXA2／PGI2比值升高［13⁃14］。由于TXA2和PGI2在体内的半衰期很短，可通过它们的代谢产物TXB2和6⁃K⁃PGF1α 的含量来代表它们在体内的水平［15］。本研究通过比较2 种黄芪对TXB2和6⁃K⁃PGF1α 的作用发现，梭果黄芪降低血栓中过度升高血栓素的能力更强，而云南黄芪能更显著升高血栓中被降低的前列环素水平，并具有较强的降低TXA2／PGI2比值的能力。因此，2 种黄芪抗血栓的作用均与抗血小板活性有关，有所区别的是，梭果黄芪主要抑制血栓素活性，而云南黄芪主要增加前列环素活性。同时，课题组前期研究也发现了2种黄芪抗血小板聚集活性的差异，梭果黄芪抑制二磷酸腺苷（ADP）诱导血小板聚集的能力更强，而云南黄芪主要抑制花生四烯酸（AA）诱导的血小板聚集［10］。这些结果均表明，梭果黄芪可能更多地影响激动剂（如血栓素和ADP）对血小板受体的激动作用来抗血栓，而云南黄芪可能主要影响血小板代谢途径来抑制血栓形成。2 种黄芪抗血栓活性的差异可能与其所含化学成分含量的差别和种类差异有关。课题组研究发现，梭果黄芪含有与正品黄芪类似的环阿屯烷型三萜皂苷类化合物［8］，而云南黄芪的化学成分大多为甾体类成分，未见环阿屯烷型三萜皂苷［9］。因此，尽管均有抗血栓活性，2 种黄芪的作用机制可能存在差异。需要注意的是，虽然梭果黄芪具有较强的体外和体内抗血栓活性，但是也有较强的出血风险，可增加小鼠尾出血时间，不过与阳性药阿司匹林比较，梭果黄芪的抗体内血栓作用相当，而出血风险明显降低。此外，云南黄芪对于体内血栓作用的风险／效益比较好，也具有开发潜力。

综上所述，相较于正品黄芪，云南特殊生态环境中的黄芪属植物更具有抗血栓药物开发潜力，但其作用机制有待进一步阐明。