烧伤后增生性瘢痕组织中颗粒蛋白前体、环氧合酶2的表达水平及其与炎性因子的相关性▲

黄 云 许喜生 陈 凯 李 佳

(郴州市第一人民医院烧伤整形外科，湖南省郴州市 423000)

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是烧伤伤口愈合的常见并发症，随着时间的推移，HS可导致患者身体活动受限(如挛缩、紧绷、僵硬等)、神经性症状(如疼痛、瘙痒等)，甚至产生焦虑，严重影响烧伤幸存患者的身心健康和生活质量[1]。近年来，HS的治疗方法已有较大进展，然而HS一旦发生，很难通过非手术方式彻底清除[2]。因此，了解HS的发病机制，做到早期防治至关重要。颗粒蛋白前体(progranulin，PGRN)是一种多功能分泌蛋白，在细胞增殖、肿瘤发生及炎症反应调节中起重要作用，还广泛参与神经系统和其他系统的各种疾病，如胃炎、败血症、结肠癌等[3]。研究表明，PGRN对机体损伤后的修复过程具有重要的调控作用[4]。环氧合酶(cyclooxygenase，COX)也被称为前列腺素内氧化酶还原酶，目前发现COX包含2种异构体，分别为COX-1和COX-2，其中诱导型COX-2作为炎性反应的介质，参与多种病理生理过程，其表达水平在炎症刺激下呈增高趋势[5]。此外，瘢痕组织中COX的表达水平增高，使用相关药物阻断COX的表达可能是治疗病理性瘢痕的辅助手段[5]。因此，本研究检测PGRN和COX-2在烧伤后HS组织中的表达水平，分析其与炎性因子的相关性，初步探讨PGRN和COX-2在烧伤后HS中的作用机制。

1.1 临床资料 选取2018年9月至2019年9月在我院烧伤整形外科诊治的54例烧伤后HS患者，其中男性30例、女性24例，年龄18～48(28.59±7.8)岁；
肩背部和四肢烧伤32例、面颈部烧伤22例。纳入标准：(1)经临床和病理学检查确诊为烧伤后HS；
(2)瘢痕切除术前未接受其他瘢痕治疗；
(3)无家族性瘢痕增生史及金属元素接触史；
(4)病理检查提示无恶变。排除标准：(1)合并血液系统疾病者；
(2)依从性差者；
(3)合并瘢痕疙瘩者；
(4)合并皮肤疾病者；
(5)妊娠或哺乳期妇女；
(6)合并恶性肿瘤者；
(7)瘢痕组织局部感染者。本研究经过我院医学伦理委员会批准，所有患者均对本研究知情同意。

1.2 主要试剂与仪器 PGRN多克隆抗体(上海烜雅生物科技有限公司，货号：XY-KT-1824)，COX-2多克隆抗体(上海群己生物科技有限公司，货号：PAB24809)，山羊抗兔IgG(H+L)二抗工作液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：A0277)，辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液、DAB试剂(北京索莱宝科技有限公司，货号：SE068、DA1010)，苏木素染色液(百济神州生物药业有限公司，货号：C8470)，TRIzol试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,货号：10296028)，反转录试剂盒和AceQ qPCR SYBR® Green Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号：R133-01、Q511-02/03)。微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司，型号：NanoDrop 2000c)，电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司，型号：HH-B11)，立式冷藏柜(青岛海尔股份有限公司，型号：BCD-227B型)，微型超速冷冻离心机(Beckman Coulter公司，型号：BEA21)，石蜡切片机(江苏世泰实验器材有限公司，型号：RM2245)，光学显微镜(日本Olympus公司，型号：CX23)，实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司，型号：CFX384)。

1.3 方法

1.3.1 标本获取：在瘢痕切除术过程中收集患者的HS组织样本0.5 g，同时留取患者植皮取皮时多余的正常皮肤组织标本0.5 g。将新鲜采集的一部分标本固定在10%的中性甲醛中，使用乙醇进行常规脱水，浸泡在二甲苯中，然后石蜡包埋，做成4 μm厚的切片待用。将其余部分标本置于-80 ℃液氮中保存待用。

1.3.2 免疫组织化学染色：将1.3.1中的切片进行常规脱蜡；
在0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)中煮沸(95 ℃)18 min进行抗原修复；
在切片上滴加3% H2O2室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶的活性，采用PBS冲洗切片3次，每次3 min；
滴加正常兔血清孵育20 min，甩去多余液体；
滴加250 μL PGRN(稀释比1∶200)和250 μL COX-2多克隆抗体(稀释比1∶150)，置于4 ℃冰箱孵育过夜，使用PBS冲洗切片3次，每次5 min；
滴加100 μL山羊抗兔IgG二抗工作液(稀释比1∶1 000)，37 ℃孵育40 min，使用PBS冲洗切片3次，每次5 min；
滴加50 μL辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，使用PBS冲洗3次，每次5 min；
DAB显色，水洗后使用苏木素进行复染；
梯度乙醇脱水、透明、干燥，中性树胶封片，置于显微镜下观察。随机观察5个视野，计数100个细胞确定阳性细胞的百分比，阳性细胞的判定：PGRN主要定位于细胞质内，呈棕黄色颗粒状；
COX-2主要定位于细胞浆中，呈棕黄色颗粒、弥漫分布。结果判读：阴性指阳性细胞百分比<6%；
弱阳性指阳性细胞百分比为6%～<26%；
阳性指阳性细胞百分比为26%～49%；
强阳性指阳性细胞百分比>49%。其中弱阳性、阳性、强阳性均定义为阳性表达[6]。

1.3.3 实时荧光定量PCR：参照TRIzol试剂盒说明书步骤提取各组织的总RNA，然后参照反转录试剂盒说明书的操作步骤将RNA反转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用AceQ qPCR SYBR® Green Mix进行实时荧光定量PCR。反应体系包括AceQ qPCR SYBR® Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，ddH2O加至10 μL。反应条件：预变性95 ℃，90 s；
变性95 ℃，30 s，退火63 ℃，30 s，延伸72 ℃，15 s，共40个循环。以β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算PGRN、COX-2、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-1β及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA相对表达水平。每组实验重复3次。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料采用(x±s)表示，组间比较采用配对t检验；
计数资料采用例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；
相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 HS组织与正常皮肤组织中PGRN、COX-2蛋白阳性表达率的比较 HS组织中的PGRN和COX-2蛋白阳性表达率均高于正常皮肤组织(均P<0.05)，见表2。

表2 HS组织与正常皮肤组织中PGRN、COX-2蛋白阳性表达率的比较[n(%)]

2.2 HS组织与正常皮肤组织中PGRN、COX-2及炎性因子mRNA表达水平的比较 HS组织中PGRN、COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA表达水平均高于正常皮肤组织，IL-10 mRNA表达水平低于正常皮肤组织(均P<0.05)，见表3。

表3 HS组织与正常皮肤组织中PGRN、COX-2及炎性因子的mRNA相对表达水平比较(x±s)

2.3 HS组织中PGRN、COX-2、炎性因子的mRNA表达水平的相关性 Pearson相关性分析结果显示，HS组织中PGRN mRNA表达水平与COX-2 mRNA表达水平呈正相关(r=0.489，P=0.003)；
HS组织中PGRN和COX-2的mRNA表达水平与IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平均呈正相关，与IL-10的mRNA表达水平均呈负相关(均P<0.05)。见图1、表4。

表4 HS组织中PGRN、COX-2的mRNA表达水平与炎性因子mRNA表达水平的相关性

HS是烧伤伤口愈合最常见的后遗症，研究表明，在烧伤伤口愈合1年内31%～90%的患者会出现HS[7]。尽管药物疗法和手术切除能够治疗HS，但复发率仍较高[8]。深入了解HS潜在的形成机制，有助于发现预防和治疗HS的新靶点。

研究表明，慢性炎症反应与瘢痕形成有关[9]。PGRN是一种多功能生长因子，能够调节机体自身免疫和炎性反应，参与多种生物过程。Jing等[10]发现，系统性红斑狼疮患者血清PGRN水平升高，体外研究表明PGRN缺乏会导致炎性细胞因子减少，PGRN在系统性红斑狼疮的发展中发挥促炎作用。还有研究表明，PGRN mRNA在正常皮肤组织中几乎不表达，但在皮肤创伤后迅速呈现高表达水平，可促进炎症细胞浸润，延缓创伤愈合的过程[3]。PGRN可以直接作用于真皮成纤维细胞，在伤口愈合过程中可以促进成纤维细胞的增殖和迁移，而越来越多的学者认为真皮成纤维细胞的过度增殖与HS的形成密切相关[11-12]。本研究结果显示，HS组织的PGRN蛋白阳性表达率及mRNA表达水平均高于正常皮肤组织(均P<0.05)，这表明PGRN在HS的形成中发挥重要作用。COX-2是诱导型炎性因子，与多种炎症反应相关。有学者发现，在HS组织和瘢痕疙瘩组织中均能检测到COX-2的阳性表达，并且认为局部应用COX-2阻滞剂抑制炎症反应，可阻断前列腺素E2的产生，减少瘢痕形成[5]。本研究结果显示，HS组织的COX-2蛋白阳性表达率及mRNA表达水平均高于正常皮肤组织(均P<0.05)，说明COX-2表达水平升高与HS的形成相关。另外，本研究进一步分析发现，HS组织中PGRN mRNA表达水平与COX-2 mRNA表达水平呈正相关(P<0.05)。因此我们推测，PGRN、COX-2可能共同在HS的形成机制中发挥作用，但具体作用机制仍需进一步研究。

IL-1β、IL-6和TNF-α是常见的促炎细胞因子，IL-10是一种重要的抗炎因子。研究表明，IL-1β、IL-6和TNF-α在HS组织中呈高表达水平，IL-10在HS组织中呈低表达[13-14]。本研究结果显示，HS组织中的IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平均高于正常皮肤组织，IL-10的mRNA表达水平低于正常皮肤组织(均P<0.05)，与上述研究结果一致。这表明这些炎症细胞因子可能是HS形成过程中的重要调节因子。本研究进一步分析发现，HS组织中的PGRN mRNA、COX-2 mRNA表达水平与IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达水平均呈正相关，与IL-10 mRNA表达水平均呈负相关(均P<0.05)，这提示PGRN、COX-2可能通过调控这些炎性因子的产生，参与HS的形成。

综上所述，与正常皮肤组织相比，HS组织中PGRN、COX-2呈高表达，两者可能通过调节IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的产生，促进炎症反应，参与烧伤后HS的形成。