2018年我国小麦赤霉病菌对多菌灵抗性检测

衣丽淑,许景升,徐 进,冯 洁,曲忠峰,田海月,张 昊,3*,陈万权*

(1.甘肃农业大学植物保护学院,兰州 730070;2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193;3.农业农村部国家植物保护甘谷观测实验站,天水 741000;4.山东省平度市农业农村局,平度 266700;5.青岛市农业技术推广中心,青岛 266000)

镰刀菌引起的小麦赤霉病(FHB)是一种毁灭性的病害,不仅影响小麦产量,还可产生多种真菌毒素污染麦粒,对人畜健康构成威胁。由于缺乏抗性品种,化学防治成为防控赤霉病的主要手段。

在小麦抽穗扬花期施用苯并咪唑类(methyl benzimidazole carbamates,MBCs)杀菌剂,对防治小麦赤霉病取得了有目共睹的效果[1-3]。研究发现苯并咪唑类杀菌剂通过与病原真菌的β-微管蛋白结合影响微管的装配,从而抑制病原菌的菌丝生长[4-7]。病原菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性是由β-微管蛋白基因的点突变引起氨基酸序列改变,使微管蛋白的构象发生变化,杀菌剂与病原菌结合力降低所致。先前的研究表明,β-微管蛋白第6、50、167、198、200位和240位的氨基酸改变可引起病原菌对MBC的抗性[8-11]。在禾谷镰刀菌复合种(FGSC)基因组中,有两个同源的β-微管蛋白基因(Tub1 andTub2)。研究表明,赤霉病菌的抗药菌株和敏感菌株具有相同的Tub1序列[1]。禾谷镰刀菌复合种对苯并咪唑类的抗性主要是由于Tub2 (FGSG06611)突变,而不是Tub1 (FGSG09530)突变[12]。迄今为止,在具有苯并咪唑类抗性田间分离株中至少检测到5种不同的Tub2基因突变类型:F167Y、E198L、E198Q、E198K和F200Y[2,12-14]。并且Tub2基因的不同密码子突变和相同密码子的不同替换均可导致对多菌灵不同的抗性水平。F167Y、E198Q和F200Y点突变导致菌株对多菌灵中度抗性,而E198L和E198K的点突变可导致菌株对多菌灵高度抗性[12,14]。在田间抗多菌灵赤霉菌中,F167Y、E198Q和F200Y是最常见的突变类型,前两种的突变频率可高达95%[15]。

自1972年将多菌灵用于防治小麦赤霉病,该杀菌剂在我国用于赤霉病的防治已有40多年的历史[16]。由于其作用位点专一且专化性强,容易产生抗药性,抗苯并咪唑类杀菌剂的菌株已在多种病原真菌中检测出来[5,10,17-23]。我国从1985年起,就对禾谷镰刀菌复合种的抗性问题进行持续监测[24]。1992年首次在浙江省检测到田间抗多菌灵的禾谷镰刀菌菌株[25],随后在长江中下游麦区的江苏、安徽和上海地区不断发现抗性菌株,随着抗性群体的不断扩大,多菌灵对江浙沪地区赤霉病的防治效果显著下降[1-2,26]。张雁南等[27]和Zhang等[28]监测了1985年-2008年江苏省禾谷镰刀菌复合种对多菌灵的抗性频率,发现抗药菌株频率与赤霉病严重程度密切相关。在赤霉病暴发严重时农民施用更多的多菌灵,增加了药剂的选择压力,导致随后几年的抗性频率升高。据报道,当抗性菌株占赤霉病菌群体10%时,多菌灵防治病害效果将下降37.5%[15]。Zhang等发现抗多菌灵菌株产生的毒素含量显著高于敏感菌株[28],意味着在已经产生抗性群体的地区,多菌灵不仅不能有效防治病害,还会刺激病原菌在麦粒中的毒素产量。因此,监测赤霉病菌对多菌灵的抗药性频率,对于防治赤霉病药剂的选择具有重要指导意义。

传统的杀菌剂抗性检测主要采用菌落直径法,通过将田间分离得到的病原菌置于含药培养基上,根据杀菌剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为抗性菌株。该方法工作量大、耗时长,且在病原菌培养过程中易受杂菌污染,使结果发生偏差。基于单核苷酸多态性,分子生物学快速发展,已在植物病原菌对杀菌剂的抗性检测方面广泛应用。Luo等[29]应用PIRA-PCR技术检测抗多菌灵的F167Y、F200Y菌株。Liu等[2]设计了等位基因特异性聚合酶链反应引物快速检测含有F167Y、E198Q和F200Y突变的抗性菌株。Hou等[30]用环切PCR方法特异性检测F167Y突变型的菌株。Duan等[31-32]建立了采用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测F167Y和F200Y突变型的菌株。Zhang等[33]建立了基于单核苷酸多态性位点确定基因型的方法,快速检测赤霉病菌抗性菌株的不同突变类型。以上分子检测方法比传统菌丝生长抑制法具有快速、特异、准确的优势。

2018年我国小麦赤霉病大流行,发生面积超过666万hm2,多菌灵仍然是部分麦区主要防控用药之一。本研究采用分子检测法,对2018年我国主要麦区赤霉病菌群体进行了多菌灵抗性突变位点检测,明确各小麦产区赤霉病菌抗性频率,为杀菌剂合理选用,延缓抗性,有效防治赤霉病提供重要依据。

1.1 试验材料

供试菌株于2018年采自黄淮麦区(河北、河南、山东和陕西)、长江中下游麦区(湖北、安徽和江苏)以及西南麦区(四川)共8个省份,107个采样点(表1),进行单孢分离纯化[34],并根据Xin等[35]报道的快速提取植物组织中DNA的方法,提取赤霉病菌的基因组DNA,并用引物Fg16F和Fg16R[36]扩增基因组DNA(表2),根据扩增条带大小区分Fusariumasiaticum和F.graminearum,其中F.asiaticum扩增片段大小为500 bp,F.graminearum扩增片段大小为400 bp,共获得1 464株禾谷镰刀菌复合种菌株(表3)。

表1 本研究8个省份107个采样点信息列表Table 1 The information of 107 sampling sites in eight provinces in this study

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 试验方法

1.2.1抗性菌株为F167Y、F200Y突变类型鉴定

采用Liu等[2]设计的PCR引物Tub2-F、167-RB及200-RB(表2)对镰刀菌基因组DNA进行PCR扩增,其中F167Y、F200Y两种突变类型的菌株扩增产物分别为398 bp和498 bp。PCR反应体系为20 μL,其中3个引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqMix 10 μL,DNA模板 1 μL,双重蒸馏水 6 μL。PCR反应程序:95℃预变性3 min;94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸 45 s,35个循环;72℃延伸5 min。

1.2.2抗性菌株为E198Q突变类型鉴定

采用引物Tub2-F和198-RB(表2)对镰刀菌基因组DNA进行PCR扩增,产物片段大小为494 bp。PCR反应体系为20 μL,其中包含Tub2-F(10 μmol/L)1 μL,198-RB(10 μmol/L)1 μL,2×TaqMix 10 μL,DNA模板 1 μL,双重蒸馏水 7 μL,PCR反应程序同1.2.1。

1.2.3凝胶电泳检测条带长度

将PCR扩增后的产物取5 μL于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测,EB染色后于凝胶成像系统检测条带大小。

2.1 多菌灵总体抗性频率及抗性突变类型

1 464株菌株抗性检测结果发现(表3),1 367株(93.37%)对多菌灵敏感,97株(6.63%)对多菌灵具有抗性;其中82株菌株(84.54%)突变类型为F167Y,11株(11.34%)为E198Q类型突变,4株(4.12%)为F200Y类型突变。

2.2 不同地区多菌灵抗性频率及抗性突变类型

不同省份多菌灵抗性发生频率不同,湖北、安徽、江苏、河北、河南以及四川6个省份的多菌灵抗性频率分别为0.34%、30.77%、40.83%、0.68%、2.52%、0.46%。山东、陕西两省没有发现多菌灵抗性菌株。其中,安徽多菌灵抗性菌株F167Y的点突变类型占85%,E198Q的点突变类型占15%。江苏抗性菌株F167Y的点突变类型占86.96%,E198Q的点突变类型占7.25%,F200Y的点突变类型占5.8%。然而,河南与安徽和江苏的结果相反,抗性菌株携带E198Q点突变频率高于携带F167Y的点突变频率。河北、湖北、四川3个省份均只发现含F167Y的点突变菌株(表3)。

表3 采样地区、菌株数量及对多菌灵抗性菌株类型、抗性频率Table 3 Sampling sites,number of isolates,types and resistance frequency of carbendazim-resistant isolates

本研究对2018年采自我国主要麦区的1 464株小麦赤霉病菌菌株进行多菌灵抗性检测,结果显示:97株对多菌灵具有抗性,其总体抗性频率为6.63%。自1992年首次检测到多菌灵抗性菌株至今抗性频率高达6.63%,说明病原菌对多菌灵抗性日益严重,抗性群体不断扩大,将导致多菌灵防效降低甚至失效。通过比较8个省份多菌灵抗性发生频率发现,长江中下游麦区赤霉病菌抗性频率明显高于黄淮麦区的群体。原因可能与我国不同地区小麦生长季内多菌灵的使用频率不同有关。在江苏、安徽等长江中下游麦区赤霉病流行频率高,发生程度严重,常在小麦抽穗扬花期施用2～3次多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂防控小麦赤霉病[3,14,3],而河北、河南等黄淮麦区其流行频率较低且发生较轻,多菌灵的使用频率较低。杀菌剂对病原菌种群施加选择压力,通常在一个季节使用杀菌剂越频繁,检测出抗杀菌剂菌株的频率就越高[5]。

有研究报道F167Y是最常见的点突变类型[2,12]。本研究中优势点突变类型为F167Y,其次为E198Q和F200Y。其中F167Y和E198Q两类突变频率超过了95%,与2014年Liu 等报道的F167Y和E198Q为主要突变类型结论一致[15]。

本研究中安徽(30.77%)、江苏(40.83%)、河南(2.52%)等省份的多菌灵抗性频率,相比之前研究中安徽(8.2%)[14]、江苏(15.3%)[37]、河南(1.2%)[38]的抗性频率大幅度上升。Liu等[15]、戴大凯等[39]对河北、四川省多菌灵抗性检测中未发现抗性菌株,而本试验中检测到频率较低的抗性突变菌株。这与近几年赤霉病的连续发生以及多菌灵持续用于防治赤霉病有关。这些结果表明，在多菌灵的选择压力下,抗多菌灵群体发展迅速。2010年和2012年我国小麦赤霉病大流行时,已经发现江苏、安徽由于赤霉病菌抗性问题,多菌灵防效下降。近年来,管理部门在江淮地区推荐采用戊唑醇等杀菌剂替代多菌灵用于赤霉病防治,多菌灵在这些区域的使用量已经大大降低。但我们的研究表明,江淮地区多菌灵抗性菌株频率仍维持在较高水平。这可能是由于抗性菌株相比于敏感菌株具有更强的适合度[28],减少用药量并不能在较短时间内使抗性频率下降。

长江中下游麦区的安徽、江苏两省多菌灵抗性菌株普遍存在,黄淮及西南麦区也出现了较低频率的抗性菌株。为防止抗性群体的进一步发展,致使多菌灵防治赤霉病失效,建议在多菌灵抗性严重的江苏、安徽等地,选择不同作用机理的杀菌剂如戊唑醇、氰烯菌酯替代多菌灵,在抗性频率较低以及没有检测到抗性菌株的地区,采用混配、复配药剂、不同作用机理的杀菌剂交替轮换使用来防治小麦赤霉病。