橡胶树不同种群炭疽菌对杀菌剂的敏感性

贺竞锋，刘先宝，李博勋，蔡吉苗，冯艳丽，黄贵修

（1. 海南大学 热带作物学院，海口 570228; 2. 中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口 571101）

橡胶树炭疽病是一类由炭疽属(Colletotrichum)真菌侵染引起的重要叶部病害[1]。该病在橡胶树不同叶龄期、不同生长阶段的多个组织上均能发生危害，给天然橡胶生产带来严重损失。目前，橡胶树炭疽病病原菌主要有胶孢炭疽菌(Colletotrichum glocosporioidesPenz.)、尖孢炭疽菌(C. acutalumSimmons)和 博 宁 炭 疽(C.boninense)3个复合种，每个复合种内又包括多个种。其中，胶孢炭疽复合种包括暹罗炭疽(C.siamense)、果生刺盘孢(C. fructicola)和乐东炭疽(C.ledongense)等，尖孢炭疽复合种下包括华南炭疽(C. australisinense)、版纳炭疽(C. bannanense)和C. laticiphilum等。暹罗炭疽和华南炭疽是引起我国橡胶树炭疽病的优势种[2]。由于复合种间、种间生物学特性存在较大差异，由此推测不同复合种对药剂的敏感性存在差异。目前，化学防治是橡胶树炭疽病的主要防治方法。以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂(BMZs)和以咪鲜胺为代表的三唑类(DMIs)杀菌剂是防治橡胶炭疽病的主要药剂[3]。苯并咪唑类杀菌剂的主要作用机制是特异性地与病原真菌的β微管蛋白结合，进而干扰微管装配，抑制病原菌的生长。而三唑类杀菌剂防治病害的机制是抑制真菌体内CytP450单加氧酶的活性，破坏麦角甾醇生物合成，导致细胞膜损伤而死亡[4]。印尼、马来西亚和泰国等国家使用甲基托布津和8-hydroquinone coffer防治橡胶树炭疽病，国内则普遍使用多菌灵。国内学者在复合种的水平上对橡胶树胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌进行了药剂敏感性的评价[5−7]，但目前尚未见橡胶树炭疽菌不同种群对杀菌剂敏感性评价与分析的报道。为了解橡胶树不同炭疽菌种群对不同杀菌剂敏感性的差异，笔者开展了不同炭疽菌种群对不同杀菌剂的敏感性研究，旨在为生产上科学合理用药提供参考。

1.1 供试菌株及来源供试的17株菌株已经明确其分类地位[8]，均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所保存(表1)。

表1 供试菌株及来源

1.2 供试药剂供试的8种药剂均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带工业原料作物病害课题组提供(表2)[9−10]。

表2 供试杀菌剂信息

1.3 带毒培养基的配置将供试药剂用二甲基甲酰胺溶解，然后配制为母液备用。向灭菌后的马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基中添加不同体积的母液，配置成不同浓度梯度带毒培养基。供试药剂的浓度梯度见表3。

1.4 橡胶炭疽菌的敏感性测定用打孔器从PDA平板培养5 d的炭疽菌落外缘打取直径为5 mm的菌饼转接在含不同浓度供试药剂(在预备试验的基础上确定药剂合适的浓度梯度，详见表3)的 PDA平板培养基中，以不含农药的 PDA平板培养基为对照，菌丝朝下置于平板中央，每处理重复3次[11−12]。胶孢炭疽菌于28 ℃下培养5 d后，尖孢炭疽菌于28 ℃下培养7 d后，用十字交叉法测量菌落直径，试验数据用Excel 2021数据处理系统进行分析，求出回归方程、相关系数和EC50值。其中，计算公式[13−14]如下：

表3 供试药剂及处理浓度梯度

1.5 杀菌剂复配设计根据供试杀菌剂单剂对菌丝生长的EC50测定结果，最终选取咪鲜胺和戊唑醇进行复配，评价药剂混用后的联合作用。将咪鲜胺和 戊唑醇按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2等进行复配，测定复配剂对供试菌株菌丝生长和孢子萌发的EC50，同时按Wadley法计算增效系数(SR)。SR≤0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用。

式中：a、b分别为相应单剂在复配剂中所占比例，A、B分别为咪鲜胺和戊唑醇。

2.1 供试杀菌剂对胶孢炭疽复合种生长的影响从表4可知，咪鲜胺对菌丝生长的抑制效果最佳，其平均EC50为0.079 63 mg·L−1，胶孢复合种内果生刺盘孢敏感性稍差，乐东炭疽和暹罗炭疽的敏感性较为接近，乐东炭疽、果生刺盘孢和暹罗炭疽的 平 均EC50分 别 为0.074 25 mg·L−1、0.089 43 mg·L−1和0.074 98 mg·L−1；
对咪鲜胺·三唑酮和多菌灵表现为敏感，其平均EC50分别为0.329 6 mg·L−1和0.414 2 mg·L−1，各种对咪鲜胺·三唑酮的敏感性中，同样是果生刺盘孢的敏感性较差，乐东炭疽较为敏感。在对多菌灵的敏感性评价中，乐东炭疽菌的敏感性稍差，暹罗炭疽较为敏感；
胶孢复合种对戊唑醇，己唑醇和氟硅唑的平均EC50较为接近，分别为1.164 4 mg·L−1、1.325 7 mg·L−1和1.122 2 mg·L−1；
对腈菌唑，粉唑醇表现为不敏感。在相同的种群内，不同菌源的菌株对药剂的敏感性存在一定的差异。果生刺盘孢种内，海南的菌株对8种药剂的EC50最大，云南地区的菌株除咪鲜胺外的EC50最小。暹罗炭疽种内，云南的菌株的对咪鲜胺、氟硅唑、戊唑醇和己唑醇4种药剂中的EC50最大；
海南的菌株对粉唑醇、咪鲜胺·三唑酮和腈菌唑3种药剂中的EC50最大；
广西的菌株对多菌灵的EC50最大，其他7种药剂的EC50最小。

表4 胶孢复合种对供试药剂的敏感性 mg·L−1

2.2 供试杀菌剂对尖孢炭疽复合种生长的影响从表5可知，药剂对尖孢复合种炭疽菌菌丝生长的影响。咪鲜胺对菌丝生长的抑制效果最佳，其平均EC50为0.091 61 mg·L−1，高于胶孢复合种。尖孢复合种内又以华南炭疽最为敏感，其平均EC50为0.038 06 mg·L−1，其他3个种的敏感性较为接近，C.laticiphilum、版纳炭疽和新类群的EC50分 别 为0.125 2 mg·L−1、0.122 1 mg·L−1和0.124 7 mg·L−1；
尖孢复合种对咪鲜胺·三唑酮、戊唑醇和氟硅唑表现为高度敏感，其平均EC50分别为0.532 2、0.368 8和0.558 6 mg·L−1，各种对咪鲜胺·三唑酮的敏感性中，以C.laticiphilum和新种群较为不敏感，华南炭疽和版纳炭疽较为敏感；
对戊唑醇的敏感性中，C.laticiphilum最为敏感；
对氟硅唑的敏感性中，华南炭疽最为敏感；
对腈菌唑，粉唑醇表现为不敏感。从菌源上看，华南炭疽种内，广西的菌株对氟硅唑、粉唑醇、腈菌唑、多菌灵和己唑醇的EC50最小，广东的菌株对戊唑醇、咪鲜胺、咪鲜胺·三唑酮的EC50最小，整体来看云南的菌株最为不敏感。

表5 尖孢复合种对供试药剂的敏感性 mg·L−1

2.3 不同种对供试杀菌剂的敏感性从图1可知。在对多菌灵的敏感性中，尖孢复合种的菌株平均EC50显著大于胶孢复合种的菌株。此外，在对戊唑醇的敏感性中，胶孢复合种菌株的平均EC50显著大于尖孢复合种的菌株，在对多菌灵、腈菌唑和粉唑醇的敏感性中，尖孢复合种内的新种群的EC50显著高于其他的种，其他3个种群则没有表现出显著差异。

图1 复合种对供试药剂敏感性的平均值

2.4 供试杀菌剂复配药剂对橡胶树炭疽菌的影响从表6和表7可知，复配药剂对不同种炭疽菌菌丝生长的影响。选取效果最好的2种单剂进行复配实验，即咪鲜胺和戊唑醇，分别选取胶孢复合种和尖孢复合种内的优势种群，即暹罗炭疽YNBN7-4、果生刺盘孢GD1603和华南炭疽GX1655和YNJP162。

表6 胶孢复合种对复配药剂的敏感性

表7 尖孢复合种对复配药剂的敏感性

从增效系数上来看，对于胶孢炭疽果生刺盘孢1 603来说，咪鲜胺∶戊唑醇比例为3∶7时增效系数为0.869 5，表现为相加作用且效果最好；
对于胶孢炭疽暹罗炭疽7-4来说，咪鲜胺∶戊唑醇比例为7∶3时，增效系数为0.872 8，表现为相加作用且效果最好；
对于尖孢炭疽华南炭疽162来说，咪鲜胺∶戊唑醇比例为4∶6时，表现为增效作用且增效系数达到1.788 8；
对于尖孢炭疽华南炭疽1 655来说，咪鲜胺∶戊唑醇比例同样为4∶6时抑菌效果最佳，增效系数为0.635 9表现为相加作用。

本研究选用8种杀菌剂对橡胶树炭疽菌进行了菌丝生长抑制试验。结果表明，咪鲜胺、多菌灵、氟硅唑、戊唑醇、己唑醇、咪鲜胺·三唑酮6种药剂对橡胶树炭疽菌菌丝生长有显著抑制活性，腈菌唑和粉唑醇对病原菌菌丝抑制效果较差，多数以三唑类为代表的麦角甾醇生物抑制剂对病原菌菌丝生长有明显的抑制效果，这与麦角甾醇生物合成抑制剂的作用机理相关。有研究认为麦角甾醇生物抑制剂对菌丝生长有显著影响，但在本研究中，同为三唑类杀菌剂的粉唑醇和腈菌唑效果不佳，特别时尖孢复合种的EC50较大，抑制效果不明显，且远不及其他三唑类杀菌剂。

蔡志英等[5]于2008年对采自云南的1株胶孢炭疽菌和1株尖孢炭疽菌进行了6种药剂的敏感性测定并进行了比较，结果表明，胶孢炭疽菌与尖孢炭疽菌均对咪鲜胺最为敏感。曹学仁等[6]检测了从海南省4个市县分离获得的23株橡胶胶孢炭疽菌和20株尖孢炭疽菌对咪鲜胺和多菌灵的敏感性，结果表明，供试菌株对多菌灵的EC50值分布在0.332 3～7.425 6 mg·L−1范围内，平均值为1.714 1 mg·L−1；
对咪鲜胺的EC50值分布在0.009 1～0.113 3 mg·L−1范围内，平均值为0.036 8 mg·L−1。林春花等[7]测定了来自海南、云南、广东和广西4省22株橡胶树胶孢炭疽菌和15株尖孢炭疽菌对咪鲜胺的敏感性，结果表明，供试的37株橡胶炭疽病菌菌株对咪鲜胺的EC50值为0.022 0～0.272 1 mg·L−1，平均为(0.061 7±0.055 4) mg·L−1。本研究中，尖孢炭疽菌对多菌灵的敏感性要显著低于胶孢炭疽病菌，对咪鲜胺的敏感性与前人研究结果基本一致。此外，不同复合种对药剂的敏感性存在一定的差异。例如，乐东炭疽、果生刺盘孢、暹罗炭疽和尖孢炭疽对多菌灵的平均EC50分别为0.528 7、0.426 0、0.348 2、1.131 5 mg·L−1。尖孢炭疽对戊唑醇、腈菌唑和氟硅唑的敏感性均显著高于胶孢炭疽复合种。在同一中群内，来自不同菌源地的菌株在对同一种药剂的敏感性上，也会有一定的差异。本研究中，测定了来自海南、云南、广东和广西省胶孢炭疽和尖孢炭疽2个复合种内7个种群对8种药剂的敏感性，在前人的基础上，进一步明确了不同种群炭疽病菌的药剂敏感性。

咪鲜胺和戊唑醇均为高效、广谱﹑低毒的杀菌剂。笔者选择这2种药剂进行复配，研究其单剂和复配剂对病原菌菌丝生长的影响，采用Wadley法计算复配药剂的增效系数，最终获得了对橡胶树炭疽菌菌丝生长表现出相加作用最优复配组合。

橡胶树炭疽病是常年流行在橡胶产区的主要病害之一，对胶乳的产量造成了严重的影响，多种杀菌剂交替使用可以缓解由于长期施用单一杀菌剂产生的抗药性问题，延长杀菌剂的使用寿命。另外，戊唑醇的价格远低于咪鲜胺，二者复配能降低田间施药成本。在使用化学药剂开展田间橡胶炭疽病防治前，应首先明确胶园中病原菌的种类及其比例，选择合适的使用药剂种类和使用浓度。本研究为橡胶树炭疽病的科学用药提供了理论支持，但在自然条件下﹐由于气候、施药时期和方式、药剂与病原菌的接触程度等因素，室内毒力测定试验的结果往往与田间试验获得的结果有一定偏差。因此，本研究筛选的单剂及复配药剂组合还需田间试验进一步验证。