生地黄水提液调控Wnt-5a/ROR2通路对输尿管梗阻大鼠肾纤维化的影响

杨 雪，韩 刚，余明琼，彭 婧，张 晶

(1.唐山市协和医院，河北 唐山 063000；
2.开滦总医院泌尿外科，河北 唐山 063000)

输尿管是人体泌尿系统很重要的结构，当输尿管出现梗阻时会造成尿液引流受阻，从而出现肾积水以及输尿管扩张等情况[1-2]。输尿管梗阻往往会造成肾功能的损害，因此要进行积极的治疗[3-4]。生地黄是清热凉血药，具有养阴生津的作用,对多种肾脏疾病具有调控作用[5-6]。例如其可通过调控核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)或者AMPK通路对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤发挥干预作用[7-8]，但是其是否在输尿管梗阻引发的肾脏纤维化中发挥作用尚不清晰。Wnt蛋白(Wnt)/非典型性受体酪氨酸激酶(Atypical receptor tyrosine kinase，ROR2)信号通路是决定细胞命运的经典通路，在多种肿瘤和肝脏疾病中有较深入研究[9-10]，但是其在肾脏疾病尤其是输尿管梗阻引发的肾纤维化中的作用尚不清晰，明确生地黄水提液是否能够通过调控Wnt-5a/ROR2信号通路发挥肾保护作用对临床机制研究具有重要意义。因此本研究将通过不同剂量生地黄水提液干预输尿管梗阻模型大鼠，探究不生地黄水提液对大鼠肾脏的影响及其机制，为临床输尿管梗阻辅助治疗提供理论基础。

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：90只8周龄雄性SPF级SD大鼠(220±20)g，购于北京智飞绿竹生物制药有限公司[SYXK(京)2021-0070]。大鼠饲养条件：温度22～26 ℃，相对湿度55%～75%，噪音85 dB以下，氨浓度20 PPm以下，通风换气12次/h。本实验通过唐山市协和医院伦理委员会审核。

1.1.2 实验药品与试剂:生地黄(批号：170302011)，使用时称取生地黄200 g，加水适量，煎煮3次，每次0.5 h，过滤，合并滤液，浓缩至含原药材0.32 g/ml，于4 ℃冰箱保存备用；
盐酸咪达普利片(达爽)，(国药准字H19990153)；
戊巴比妥钠，(≥98%)购于天津市津华化工厂；
苏木精和伊红购于美国sigma公司。

1.1.3 实验仪器:SYD-K2080切片机购于沈阳誉德电子仪有限公司；
包埋剂(Optimal cutting temperature compound，OCT)购自北京普利莱基因技术有限公司；
实验动物手术器械购于玉研仪器公司；
显微镜购于北京普瑞赛司仪器有限公司；
Western blot电泳仪购于美国Bio-Rad公司；
Bright-发光成像仪购于美国赛默飞公司。

1.2 实验方法

1.2.1 输尿管梗阻模型的建立：腹腔注射5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，当大鼠麻醉好后平放并固定于手术台上，大鼠左侧肋腰点区域为术区，去除大鼠肋腰点区域约1 cm为半径大小的腹毛，充分暴露术区，备皮后在左腹部术区开1.5 cm大小手术切口，逐层打开皮层、肌层，确定肾脏位置，翻开肠襻，暴露肾脏下极并用玻璃分针游离输尿管，在输尿管上端接近肾脏下极处与中下1/3处两个地方分别用4-0医用缝合线结扎，结扎后从两个结扎点之间剪断,复原脏器位置并用青霉素局部给药，然后逐层缝合腹壁，并用碘伏棉球消毒缝合后术区。对照组手术除不结扎输尿管，也不离断输尿管，其他操作一致。

1.2.2 大鼠分组及给药方式：造模后将造模大鼠随机分为模型组、盐酸咪哒普利组和生地黄水提液低剂量组、生地黄水提液中剂量组、生地黄水提液高剂量组，每组15只，根据《实验动物管理与实用技术手册》及《中药药理研究方法学》将实验动物与人之间的给药剂量进行“等效”换算,盐酸咪哒普利组和生地黄水提液低剂量组、生地黄水提液中剂量组、生地黄水提液高剂量组分别给予盐酸咪哒普利0.9 g/(kg·d)和生地黄水提液0.8、1.6、3.2 g/(kg·d)，模型组和对照组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，连续2周，2周后进行各组实验。

1.2.3 HE染色检测肾脏病理变化：取各组大鼠肾脏组织的石蜡包埋组织，用石蜡切片机切4 μm厚度切片，60 ℃烘箱5 min；
二甲苯Ⅰ脱蜡20 min，二甲苯Ⅱ脱蜡10 min，二甲苯、梯度乙醇各1 min，自来水冲洗15 s；
苏木素染色5 min，自来水冲洗1 min， 1%盐酸乙醇分化10 s，自来水冲洗1 min；
1%稀氨水10 s，自来水洗1 min；
伊红染色1 min，自来水洗30 s；
依次运用不同浓度乙醇脱水1 min，再用95%乙醇漂色1 min，无水乙醇脱水5 min，最后放入二甲苯Ⅰ3 min，二甲苯Ⅱ3 min；
中性树胶封片后显微镜下进行观察。

1.2.4 Masson染色检测肾脏纤维化水平：将经过包埋及制片等前期处理的肾脏切片依次进行Weigert铁苏木素染色液染色10 min，后流水冲洗，置于1%盐酸乙醇分化液15 s，后流水冲洗，Masson丽春红染色10 min后，乙酸溶液浸泡洗涤1 min，再磷钼酸溶，液分化2 min，乙酸溶液浸泡洗涤1 min，甲苯胺蓝染色液染色3～5 min；
95%乙醇溶液脱水5 min，无水乙醇脱水2次，每次2 min；
二甲苯透明2次，每次5 min，中性树胶固封切片，将Masson染色后切片置于显微镜下放大200倍视野下拍照。

1.2.5 Western blot 检测大鼠肾脏组织纤维化marker及WNT通路分子蛋白表达：收集各组大鼠肾脏组织在冰上匀浆器内匀浆，用1 ml RIPA蛋白裂解液在冰上提取总蛋白，采用BCA法对蛋白浓度进行测定。加入5×SDS的蛋白上样缓冲液煮沸后分装于EP管，储存于-80 ℃备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓缩胶电压80 V 10 min，分离胶电压110 V 1.5 h，后转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭。加入特异性一抗CollagenⅠ(1∶10000，ab138492，abcam，英国)、α-SMA(1∶10000，ab108424，abcam，英国)、Vimentin(1∶5000，ab92547，abcam，英国)，WNT5a(1∶1000，ab179824，abcam，英国)，ROR2(1 μg/ml，ab190145，abcam，英国)和β-actin(1∶5000，ab6276，abcam，英国)于4 ℃冰箱过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入特异性的羊抗兔二抗(1∶2000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化学发光液曝光显影，使用Photoshop图像分析软件系统进行半定量分析。

2.1 各组大鼠一般情况及肾重/体重比值比较 对照组大鼠在假手术后初期出现暂时性食欲降低，术后精神状态恢复良好，反应灵敏，食欲良好，皮毛光亮紧密，大便正常呈颗粒状，体重增长正常。模型组大鼠在模型制备中后期大鼠出现食欲不佳，体重增长低于对照组，精神状态较差，反应迟钝，皮毛干枯稀疏，萎靡少动。各给药组大鼠在精神状态、饮食、活动情况等方面未见明显差异，表现均介于假手术组及模型组之间。同时如表1所示，通过比较各组大鼠肾重/体重比值，与对照组相比，模型组大鼠肾重/体重比值显著升高，与模型组相比，生地黄水给药组大鼠肾重/体重比值均降低，并具有一定的剂量依赖效应，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组大鼠肾重/体重比值比较

2.2 不同剂量生地黄水提液干预对大鼠肾脏组织的影响 通过HE染色确定各组大鼠肾脏病理变化水平，如图1所示。与对照组比较，模型组肾脏组织的皮质和髓质均变薄、肾小管扩张、上皮细胞脱落并伴有空泡变性、肾小球萎缩，具有炎症细胞浸润。与模型组比较，生地黄各剂量组大鼠肾脏组织的肾小球相对充盈，局部出现球囊粘连、肾小管扩张程度及小管上皮细胞空泡变性均有所改善，炎症细胞浸润减少，且具有一定剂量依赖性。

图1 各组大鼠肾脏病理表现(HE染色，×200)

2.3 不同剂量生地黄水提液干预对大鼠肾脏纤维化的影响 通过Masson染色结果确定各组大鼠肾脏纤维化水平，如图2所示。与对照组比较，模型组大鼠肾脏组织间质蓝染程度较高，表明纤维化严重。与模型组比较，生地黄各剂量组大鼠肾脏组织蓝染减少，表明纤维化程度减轻，并呈一定剂量依赖性。

图2 各组肾脏纤维化病理表现(Masson 染色，×200)

2.4 不同剂量生地黄水提液对肾脏组织纤维化标志物CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达的影响 见表2。通过Western blot实验探究不同浓度生地黄水提液对肾脏组织CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达水平的影响，结果表明与对照组相比，模型组CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达升高，与模型组相比生地黄水提液各剂量给药组大鼠CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达水平降低，并且具有一定的剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组大鼠肾脏CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达水平比较

2.5 不同剂量生地黄水提液对肾脏组织Wnt信号通路蛋白表达的影响 见表3。通过Western blot实验探究不同浓度生地黄水提液对肾脏组织Wnt5a和ROR2表达水平的影响，结果表明与对照组相比，模型组Wnt5a和ROR2表达升高，与模型组相比，生地黄水提液各剂量给药组大鼠Wnt5a和ROR2水平降低，并且具有一定的剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表3 各组大鼠肾脏Wnt5a和ROR2表达水平比较

输尿管梗阻通常是指输尿管管腔直径变小，从而导致输尿管出现堵塞，排尿出现异常的情况，引起输尿管梗阻的原因有很多，可能是局部出现了感染，也有可能是有息肉等原因[11-12]。输尿管梗阻若不及时治疗，会引发严重的肾脏损伤和肾纤维化，对患者肾功能造成恶性影响[13-14]。生地黄具有清热凉血、养阴生津的作用，可以很好地祛除体内的内热，改善肠道燥热所引起的便秘，对咽喉疼痛和口干舌燥也有很好的缓解作用。临床上也常使用生地黄来治疗糖尿病、高血压、荨麻疹、过敏性紫癜、风湿热、心律失常等病症[15-16]。研究表明生地黄可以通过干预超氧化物歧化酶和丙二醛的表达，参与氧化应激通路发挥肾脏保护作用[17]，也有研究表明生地黄可通过NF-κB/NLRP3信号通路改善高脂饲料并链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾脏发挥积极的干预作用[18],但是生地黄是否对输尿管梗阻引发的肾纤维化发挥保护作用尚不清晰。本研究通过不同剂量生地黄水提液干预大鼠输尿管梗阻模型探究生地黄水提液对输尿管梗阻后大鼠肾脏纤维化的影响，HE染色和Masson染色结果表明生地黄水提液对肾脏损伤有积极作用，可以降低炎症因子的浸润，并且显著降低了肾脏组织的纤维化水平；
同时本研究通过Western blot分析了纤维化关键生物标志物的表达水平，结果证实输尿管梗阻后大鼠肾脏组织CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达水平显著升高，这与组织病理学结果相一致，同时，当大鼠使用生地黄治疗后，CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达水平显著降低，这与Masson染色结果相一致，由此提示出生地黄水提液有助于输尿管梗阻后肾脏功能的恢复，对肾脏纤维化的抑制具有积极干预作用，其机制与抑制CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表达水平相关。

Wnt蛋白在发育、组织动态平衡、多种疾病的发生中起到了关键的作用[19]。研究表明ROR2在多种肿瘤实体中的过度表达，其信号转导在癌症研究中受到越来越多的关注，活跃的Wnt/ROR信号与推动肿瘤发展和进展的过程有关，如细胞增殖、存活、侵袭或治疗抵抗[20]，但是Wnt/ROR信号通路与肾脏疾病的研究较少，因此本研究集中探究了Wnt/ROR信号通路在输尿管梗阻引发的肾纤维化中的表达变化。通过Western blot证明模型组Wnt5a和ROR2表达升高，生地黄水提液各剂量给药组大鼠Wnt-5a和ROR2水平降低，并且具有一定的剂量依赖性，这与肿瘤学研究中发现的疾病过程中Wnt/ROR2 高表达相一致，提示Wnt/ROR2信号通路的异常激活在肾脏疾病中也发挥着重要作用，生地黄的干预抑制Wnt/ROR2信号通路，可能抑制了肾脏细胞的异常病变，从而发挥肾脏保护作用。

综上，本研究表明生地黄水提液对大鼠输尿管梗阻引发的肾纤维化具有积极意义，其机制可能与抑制异常激活的Wnt-5a信号通路有关。本研究可以进一步通过体外细胞学实验探究生地黄水提液对肾脏细胞的作用，为临床治疗提供分子依据。