基于网络药理学和分子对接探讨白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的作用机制

俞 宁，陈 健，曹烨民，曹永兵

（1.上海中医药大学，上海 201203；
2.上海中医药大学附属中西医结合医院脉管病研究所，上海 200082；
3.上海中医药大学附属中西医结合医院脉管病科，上海 200082）

血栓性浅静脉炎（superficial thrombophlebitis）是与静脉血栓形成相关的浅静脉炎症，其特征是浅静脉内血栓，管腔部分受累或闭塞，静脉沿途有炎症反应[1]。既往临床认为[2，3]，该病是一种良性、自限性下肢疾病，可影响全身大部分静脉系统，与深静脉血栓形成（DVT）或肺栓塞（PE）密切相关，是DVT 和PE 的重要危险因素。研究表明[3]，血栓扩散到深静脉的比例为6%～44%，PE 的发生率为1.5%～33%。血栓性浅静脉炎的发病率尚不明确，但被认为高于深静脉血栓形成的发病率，且据估计[4]，深静脉血栓的发病率约为1/1000。白鹤方由上海市中西医结合医院国家级名老中医奚九一教授创立，可用于治疗血管炎、胆囊炎、胃炎等疾病。药理学研究表明[5]，白鹤方通过抑制ICAM-1 表达和嗜中性粒细胞CD18 的表达，从而抑制嗜中性粒细胞与HUVEC 的粘附，发挥抗炎治疗的作用。随着大数据时代的到来和网络药理学的发展，运用药理学、生物信息学等多门学科与系统网络分析相结合，深度挖掘和整合这些多种草药组成的中医复方，阐明不同的组分之间复杂的相互作用，从多组分、多靶点的揭示药物治疗机制，可以为中医药现代化和新药研发提供思路[6]。基于此，本研究主要基于网络药理学和分子对接探讨白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的作用机制，现报道如下。

1.1 白鹤方和血栓性浅静脉炎潜在靶点检索 首先将白鹤方中的13 味中药：白芍、半枝莲、柴胡、陈皮、党参、地耳草、甘草、虎杖、蒲公英、拳参、蜀羊泉、藤梨根、仙鹤草依次输入中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]、中医药百科全书数据库ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）[8]、中医药生物信息分析平台SymMap（http://www.symmap.org/）[9]、中医药分子机制生物信息学分析工具BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）[10]和相关文献收集方剂中各单味药的主要化学成分，根据中药功效将其分为4 类。通过SWISSADME[11]网站对每种成分进行ADME 分析[12]，以胃肠道吸收和生物利用度为指标筛选潜在活性成分。通过SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）[13]预测白鹤方有效成分的主要靶标，同时符合degree 2 倍中位数以上、BC 中位数以上、CC 中位数以上的靶点作为白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的关键活性成分。通过在GeneCards（https://www.genecards.org/）[14]、DisGeNET（https://www.disgenet.org/home/）[15]、OMIM（https://www.omim.org/）[16]、Drug－Bank（https://www.drugbank.com/）[17]数据库中搜索“superficial thrombophlebitis”，即可获得预测出的血栓性浅静脉炎有关的靶点。

1.2 药物-疾病靶点筛选 通过预测获得白鹤方潜在靶点和血栓性浅静脉炎靶点，将两组数据分别输入到韦恩图绘制工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html）软件中，得到白鹤方和血栓性浅静脉炎的映射的共同靶标，即为药物-疾病靶点。

1.3 药物-疾病靶点PPI 网络构建 将上述筛选出的白鹤方和血栓性浅静脉炎的共同作用靶点利用STRING（https://string-db.org/）[18]，构建蛋白质相互作用网络。使用Cytoscape 软件中的cytoHubba 插件按照拓扑学规则计算关键节点，按照节点度Degree 排序得出PPI 网络中排名前10 的关键节点。

1.4 GO 和KEGG 通路富集分析 使用DAVID 6.8数据库[19]对上述得出的白鹤方和血栓性浅静脉炎的靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。富集分析筛选P＜0.05 的条目，并在Cytoscape 3.8.2 软件[20]中构建“化合物-靶点-通路”网络，找到白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的主要潜在生物学过程及作用信号通路。

1.5 核心靶点的分子对接模拟验证 结合文献报道[21]，选择核心靶点中drgree 程度前10 的靶点蛋白，使用利用Autodock_vina 软件用于分子对接，从RCSBPDB 数据库（http://www.rcsb.org/）获取这些靶点蛋白的晶体结构文件，从Pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取这些小分子3D 结构文件，计算靶点蛋白与活性成分间的最低结合能并将分子对接模拟验证结果进行可视化。

2.1 白鹤方的有效成分筛选和靶标预测 在TCMSP、ETCM、SymMap 等数据库及文献检索的方式对白鹤方的主要有效成分及相应的关键指标进行查询，共发现811 个成分，并通过SWISSADME 网站对所有成分的药代动力学进行筛选后，得到706 个有效成分。将这些成分输入Swiss target prediction 网站搜索潜在靶标，剔除重复项后，筛选出对应213 个靶标。其中，补气养血药中发现了89 种成分和262 个靶点，清热解毒药有110 种成分和645 个靶点，其它药材中有62 种成分和277 个靶点。不同组中草药的成分和预测目标的数量见表1。

表1 白鹤方不同组别药材的成分数量和预测靶标

2.2 血栓性浅静脉炎疾病靶点筛选结果 通过检索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET 数据库，检出与血栓性浅静脉炎相关的靶点,删除检索结果中重复靶点后共纳入257 个相关的靶点，见图1。

图1 不同疾病数据库疾病靶点的映射

2.3 核心靶点筛选及PPI 网络构建结果 在ImageGP在线软件测绘工具平台上输入213 个白鹤方有效成分作用靶点和257 个血栓性浅静脉炎疾病靶点，二者映射以绘制韦恩图，即白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的交集靶点，见图2。剔除重复后，得到白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的交集靶点20 个。通过STRING对20 个共同靶点进行蛋白质相互作用网络分析，最低交互分数为0.4，产生了20 个靶点和62 条边，平均节点度（average node degree）为6.2，平均聚类系数为0.636，PPI 网络富集的P＜2.22e-16，见图3。对构建出的互作网络使用Cytoscape 软件中的cyto－Hubba 进行分析，按节点度degree 进行排序发现排名前10 个关键节点为TNF、AKT、MP、IL、MMP9、F、MMP、MMP3、F2、MMP1，见图4。

图2 白鹤方有效活性成分与血栓性浅静脉炎靶点的韦恩图

图3 白鹤方-血栓性浅静脉炎共同靶点的PPI 网络

图4 PPI 网络中前10 个关键节点

2.4 白鹤方对血栓性浅静脉炎的调控网络分析 采用Cytoscape3.8.2 软件将白鹤方的13 味中药、306个有效活性成分及213 个潜在标点和血栓性浅静脉炎-白鹤方20 个共同靶标进行分析，根据网络拓扑值degree、BC、CC 确定白鹤方治疗血栓性浅静脉炎关键活性成分，degree 中位数2 倍值为14，BC 中位数为0.051 614 322，CC 中位数为0.305 250 905，同时符合degree 2 倍中位数以上、BC 中位数以上、CC中位数以上的靶点作为白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的关键活性成分（图5）。共有15 种活性成分满足上述要求，分别为槲皮素、山柰酚、芹黄素、叶黄素、原儿茶酸、柚木素、肉豆蔻酸、硬脂酸、反式白藜芦醇、反式香豆酸、咖啡酸、黄芩素、没食子酸、咖啡因、油酸，见表2。

表2 白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的关键活性成分及其拓朴学参数

图5 “核心成分-靶点”网络图

2.5 潜在作用靶点的GO 富集分析 利用DAVID6.8对20 个核心靶点进行GO 功能富集分析，筛选统计的P＜0.05 的生物过程，共得到GO 条目92 个，其中生物过程（BP）条目61 个、分子功能（MF）条目21个、细胞组成（CC）条目9 个。GO 功能富集分析显示，BP 主要涉及胶原蛋白分解过程、细胞外基质分解、白细胞迁移、蛋白分解、蛋白质代谢过程等过程；
MF 主要涉及同质蛋白结合、锌离子结合、钙离子结、金属肽酶活等分子功能；
CC 主要涉及质、细胞外基质、蛋白质类细胞外基、胞外区、胞外空间等细胞组分相关，见图6。

图6 GO 富集潜在靶点条形图

2.6 KEGG 通路富集分析 利用DAVID6.8 对20 个核心靶点进行KEGG 通路功能富集分析，共得到KEGG 条目72 个，见图7。其中，包括肿瘤坏死因子信号通路、雌激素信号通路、T 细胞受体信号通路、MTOR 信号通路、Fc epsilon RI 信号通路、Toll 样受体信号通路、鞘脂信号通路等信号通路，见图8。

图7 KEGG 通路分析

图8 KEGG 气泡图

2.7 分子对接模拟验证 根据药物-成分-靶点构建的网络结构，根据degree 程度选择了前10 个核心靶 点：TNF、AKT1、MPO、IL2、MMP9、F2、MMP2、MMP3、F3、MMP1，在PDB 数据库中检索经典靶点受体蛋白信息。利用Autodock_vina 软件计算这10个靶点蛋白与预测出上述靶点的活性成分间的最低结合能，结果显示活性成分分子与靶点受体蛋白周围分子通过氢键等分子间作用力形成较为稳定的构象；
白鹤方中的大多数成分都能很好地与靶基因结合，其中芹黄素、山奈酚和槲皮素的结合性能最好；
TNF、MMP3、F2、F3、MPO、MMP9 基因可以与大多数活性成分很好地对接，见表3。

表3 白鹤方的关键成分与目的靶标的结合能

本研究为了探讨白鹤方治疗血栓性浅静脉炎的作用机制，通过网站筛选发现白鹤方中706 个潜在活性成分和213 个靶点。同时，使用多个数据库筛选了257 个疾病目标。通过韦恩图映射，共发现20个共同目标。PPI 网络和GO 富集分析表明这些共同的靶基因之间存在多重互作。GO 功能从分子功能、生物过程和细胞成分3 大类分析所有靶基因的功能，最后从抗炎免疫、减少炎症损伤和抑制新生血管的形成两方面分析了各通路的信息。

研究发现，白鹤方中多种潜在活性成分均表现出良好的抗炎活性，如山奈酚、槲皮素、芹黄素、硬脂酸等。已有研究报道[22-24]，槲皮素一种具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，可降低TNF-α 的表达水平，对损伤血管有保护作用，对IL-6、IL-2、NF-κB、TNF-α 等均有较好的抑制作用，且还可以通过抑制血管生长发挥抗肿瘤作用。山奈酚是一种天然黄酮醇，可以抑制NF-κB 和MAP 激酶的磷酸化，减少IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平，具有显著的抗炎效果[25-27]。硬脂酸是硬脂酰辅酶A 去饱和酶的主要底物，可与TNF-α 通过TLR4/TBK/IRF3 信号通路促进单核细胞中巨噬细胞炎症蛋白-1α 的产生[28]。芹黄素可以显著抑制MAPK 的激活，减少TNF-α、IL-6 和NF-κB 的表达和细胞凋亡，从而抑制炎症[29]。同时，芹菜素对HIF-1α 的表达及其下游的VEGF-A/VEGFR2 和PDGF-BB/PDGFβR 信号通路有强烈的抑制作用，对新生血管有明显的抑制作用[30]。因此，本研究认为白鹤方中的这些关键成分可能通过抗炎免疫和抑制血管生成来治疗血栓性浅静脉炎。

此外，本研究中KEGG 通路富集结果发现大量的抗炎免疫通路，其中TNF 信号通路是最重要的途径，共涉及6 个调控基因：PIK3CA、MMP3、AKT1、PIK3R1、TNF、MMP9。研究报道，TNF-α 是一种促炎细胞因子，可促进炎症介质和细胞因子的表达，包括IL-6、IL-1β 和ICAM[31]，还可通过调节NF-κB 信号通路和产生多种炎症反应来调节MMPs 的表达[32]。分子对接是一种模拟小配体分子与受体蛋白大分子相互作用的技术，可以计算两个对应物之间的结合能来预测它们的亲和力。结合能小于0 表示两个分子自发结合，结合能越小，构象越稳定[6]。本研究中分子对接实验结果也显示，山奈酚、槲皮素、芹黄素、硬脂酸与关键靶蛋白MPO、MMP3、F2、MMP9 等具有较好的结合力。

综上所述，本研究通过网络药理学方法和分子对接验证，有效地阐明了抗炎免疫和抑制血管生成是白鹤方减轻血栓性浅静脉炎的核心分子机制，仙鹤草中的山奈酚、白芍中的硬脂酸等是重要的活性成分，其通过TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、T 细胞受体信号通路共同作用于MMP9、MMP12、PIK3R1、ALOX5、AKT1 等多个靶点，发挥抗炎免疫通路作用；
党参中的槲皮素、藤梨根中的芹黄素等可抑制新生血管生成，减少血栓形成，主要作用于F2、TTR、AKT1、MMP2 等下游靶标，具有调控血管生成的作用。