巴西橡胶树HbRPW8基因克隆与表达分析

官 鑫，涂 敏，蔡海滨，王云月，胡彦师，曾 霞

巴西橡胶树基因克隆与表达分析

官 鑫1,2，涂 敏2*，蔡海滨1,2，王云月1*，胡彦师2，曾 霞2

1. 云南农业大学植物保护学院，云南昆明 650201；
2. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海南海口 571101

（resistance to powdery mildew locus 8）是对植物多种病害，尤其白粉病具有抗性的广谱抗病基因位点，通过对橡胶树基因进行克隆及表达分析，为橡胶树抗白粉病机制解析和分子育种等方面打下基础。以橡胶树‘热研73397’为材料，采用RT-PCR克隆基因编码区（CDS）序列；
对其进行生物信息学分析，并利用qRT-PCR方法，测定7种激素和白粉菌侵染不同时间、不同病害等级处理后基因表达量。该基因cDNA全长570 bp，编码189个氨基酸，该蛋白的分子量为21.73 kDa，等电点为9.23，脂肪系数为86.30，总平均亲水性指数为–0.404，为亲水性蛋白，共有8个磷酸化位点，无跨膜域和信号肽，定位于细胞核，具有RPW8的保守结构域，α-螺旋和无规则卷曲是HbRPW8蛋白二级结构的主要元件，分别占氨基酸序列的70.90%和22.22%。亲缘关系显示，基因与木薯基因相似性最高。过氧化氢（H2O2）、水杨酸（SA）、乙烯利（ETH）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）能迅速诱导转录本的表达，并在处理后0.5 h达到最高水平，分别约为对照的14倍、6倍、75倍、2.5倍和4倍；
茉莉酸甲酯（MeJA）处理后6 h达到最高水平，是对照的10倍左右；
生长素处理后转录本显著下调；
随着白粉菌侵染时间和病害等级的增加，的表达量均呈现先上升后下降的趋势。研究结果初步表明，可能参与橡胶树的抗病反应机制，为橡胶树抗病育种的研究提供参考。

巴西橡胶树；
基因；
qRT-PCR；
生物信息学；

橡胶树（）是天然橡胶最重要的来源。由专性寄生病原菌（先前鉴定为橡胶粉孢）引起的橡胶树白粉病是迄今为止我国橡胶树最重要的叶部病害，发病严重时可导致橡胶胶乳产量损失多达45%[1-3]。（resistance to powdery mildew locus 8）是对植物多种病害，尤其白粉病具有抗性的广谱抗病基因位点[4-6]。因此，深入研究橡胶树基因的白粉病菌胁迫响应机制对橡胶树抗白粉病品种改良具有重要意义。

是在2001年用图位克隆法从高抗白粉病的拟南芥Ms-0生态型中克隆的一个广谱抗性基因，这一基因位点包含2个紧密连锁的基因：和[7-8]，它们在氨基酸序列上具有65%的相似性，均在N端含1个跨膜结构域TMD与1～2个卷曲螺旋结构域（coiled-coil，CC），不含典型R基因所具有的NB-LRR或者eLRR结构[9-11]。尽管的结构独特，却仍然用与NB-LRR抗性蛋白相同的水杨酸信号传导途径产生广谱抗病性[12]。具有组成性表达特征，定位于叶绿体周围，能增强PTI信号，介导H2O2和PCD的产生，从而产生多病害抗性[13]。与乙烯信号调控模块在维持拟南芥生长和抗病之间的平衡发挥着重要的作用[14]。的表达受白粉菌侵染诱导，其蛋白特异锚定于吸器外质膜（extra-haustorial membrane, EHM）上，运输到EHM的过程依赖于细胞骨架和自身2个富含精氨酸和赖氨酸的保守元件（R/K-R/K-x-R/K）[15]。所介导的抗性反应包括水杨酸的积累、H2O2的积累、基因的升高、胼胝质的沉积和HR反应[16-18]。目前，已在拟南芥[7]、苹果[19]、葡萄[20]、甘蓝型油菜[5]、木薯[21]、杏[22]、草莓[23]等植物中发现抗白粉病RPW8家族基因，均含有RPW8特征结构域且基因具有较高的组织表达特征。同时，基因也在不同植物中拓展了抗白粉病功能的研究，如将十字花科拟南芥中基因转入茄科的烟草中，可提高转基因植株抗白粉性[4]；
甘蓝型油菜中同源基因转入拟南芥中，有部分基因具有抗白粉菌的功能[24]；
转基因葡萄对白粉菌抗性也强于野生型[25]。

随着研究的不断深入，植物基因的功能及抗病机理被逐渐认识，但该基因在橡胶树中的研究却未见报道，相关基因的克隆、表达分析、功能验证等均需进行研究。本研究以橡胶树全基因组数据为基础，克隆橡胶树无性系‘热研73397’中的基因，分析其核酸序列的特征、蛋白质理化性质、蛋白保守结构域、系统进化关系等信息，并对其响应橡胶树白粉菌侵染及各类激素诱导的表达模式进行研究，有利于更加深入了解RPW8基因家族功能，同时也为橡胶树抗白粉病基因挖掘和抗白粉病育种提供理论参考。

1.1 材料

植物材料为巴西橡胶树无性系‘热研73397’芽接苗，种植于海南儋州的国家橡胶树种质资源圃内，待叶片物候期进入古铜期时处理使用。

试剂：感受态细胞（DH5α）、测序载体（pMD19-T载体）、2×PCR MasterMix、T4连接酶、DL2000 marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；
Omega植物DNA提取试剂盒、Omega植物RNA提取试剂盒、Omega切胶回收试剂盒、实时荧光定量试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix均购自北京全式金生物技术有限公司。

仪器设备：赛默飞梯度PCR仪MiniAmp Plus Thermal Cycler、超微量核酸蛋白分析仪Thermo Fisher Nano Drop 2000、Biometra电泳仪、ChemiDoc MP凝胶成像、TGreen切胶仪、荧光定量PCR仪CFX96TM Real-Time System。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和反转录 将采集的橡胶树叶片用液氮充分研磨，取100 mg植物材料于无RNA酶的1.5 mL离心管中，参照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，RNA的浓度与纯度通过Nano Drop 2000检测，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，利用反转录试剂盒获得cDNA。

1.2.2基因克隆 根据GenBank上公布的拟南芥（AF273059）基因序列，在橡胶树转录组数据库（hevea.catas.cn）中进行blastx搜索同源基因片段（scaffold0100_324660），通过分析得到橡胶树基因的cDNA序列及其起始密码子上游2000 bp的启动子序列。采用Primer Premier 5.0软件设计基因特异引物 （表1），以‘热研73397’的cDNA为模板，利用PCR扩增的全长序列，对PCR产物进行切胶回收，连接pMD-19T载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含氨苄抗性培养基上培养，检测后挑取阳性克隆送往铂尚生物技术（上海）有限公司测序。

表1 本研究引物序列

1.2.3 HbRPW8生物信息学分析及进化分析 利用Signal P-5.0 Server（http://www.cbs.dtu. dk/ services/Signal P/）在线软件分析信号肽，TMH MM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）在线软件预测跨膜结构，Plantm PLoc（http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/ plant/）在线软件预测亚细胞定位，PSIPRED V4.0（https:// github.com/psipred/psipred）在线软件预测二级结构，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy. org/）在线软件预测三级结构，Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp­sb.cgi）在线软件分析保守结构域，Prot Param（https://web.expasy.org/protparam/）在线软件工具对其理化性质进行生物信息学预测分析，NetPhos-3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/serv ice.php?NetPhos-3.1）在线软件预测磷酸化位点。利用Plant CARE软件对其启动子顺式作用元件进行预测。使用DNAMAN9软件进行多序列对比同源相似性。使用MEGAX软件采用邻接法（neighbor-joining）进行系统发育分析（bootstrap值设为1000）。

1.2.4 不同处理下表达分析 参照WANG[26]的方法，使用过氧化氢（H2O2）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、生长素（IAA）、乙烯利（ETH）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）等7种激素和白粉病菌处理橡胶树古铜期叶片，激素处理后分别采集0、0.5、2、6、12、24 h的叶片，白粉病菌处理后分别采集0、3、6、12、24、48、72 h的叶片；
用白粉菌侵染橡胶树古铜期叶片，10 d后挑选0～5级感病叶片。根据编码蛋白序列设计荧光定量引物（表1），选用橡胶树基因为内参，采用SYBR Green法进行qRT-PCR检测，反应体系和程序参考覃碧等[27]的方法。

1.3 数据处理

相对表达量结果采用2–ΔΔCT法计算，采用IBM SPSS Statistics软件进行单因素ANOVA检验分析差异显著性，采用OriginPro 2021软件进行作图。

2.1 HbRPW8基因的克隆分析

PCR克隆得到全长序列为716 bp（图1），其中基因ORF全长570 bp，编码189个氨基酸 （图2），Genebank ID为ON012520，其中含量最丰富的氨基酸为赖氨酸（Lys），占12.7%，其推导的氨基酸分子量是21.73 kDa，等电点为9.23，分子式C966H1577N261O279S13。正负电荷残基数分别为32和26，脂肪系数是86.30，不稳定系数为47.95，总平均亲水性–0.404，为亲水性蛋白。

M: DL2000 DNA marker.

图2 HbRPW8基因CDS区核苷酸序列及其推导氨基酸序列

2.2 橡胶树HbRPW8蛋白的生物信息学分析

2.2.1 信号肽、亚细胞定位、跨膜区及磷酸化位点预测 将获得的cDNA序列翻译成氨基酸序列后，利用生信软件预测HbRPW8蛋白存在信号肽的概率为0.0159，故推测HbRPW8是非分泌蛋白（图3A），HbRPW8蛋白定位于细胞核且无跨膜结构域（图3B），为非膜蛋白。HbRPW8肽链中可能发生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位点有8个，其中苏氨酸磷酸化位点和丝氨酸磷酸化位点各4个，无酪氨酸磷酸化位点（图3C）。

2.2.2 HbRPW8蛋白保守结构域及二、三级结构预测 生信分析表明HbRPW8在8～128 aa之间存在1个RPW8保守结构域（图4A）。在HbRPW8蛋白的二级结构中，α-螺旋占70.90%，β-折叠占0.53%，无规卷曲占22.22%；
α-螺旋和无规卷曲是HbRPW8蛋白二级结构的主要元件（图4B）。其三级结构与二级结构预测结果相符合（图4C）。

2.3 HbRPW8基因编码蛋白质同源序列比对分析及系统进化分析

HbRPW8氨基酸序列与橡胶树LOC110655851（, XP_021668 009.1），木薯LOC110628052（, XP_021630188.1），蓖麻RPW8（, XP_015576721.1），拟南芥RPW8.1（, AAK09266.1），拟南芥RPW8.2（, AAK09267.1）进行序列比对，总相似度达到53.4%（图5）。并根据分析的结果标注RPW8保守结构域。

图3 HbRPW8蛋白质的信号肽（A）、跨膜结构域（B）和磷酸化位点（C）预测

为阐释橡胶树RPW8的进化关系及分类地位，从NCBI下载甘蓝型油菜、拟南芥、蓖麻、木薯、梨、毛白杨、番茄、马铃薯、黄瓜、烟草、葡萄、梅、草莓和桃共14个物种的RPW8蛋白序列及与巴西橡胶树相似度为100%的蛋白序列，通过构建系统发育进化树可知，橡胶树HbRPW8与已公布的巴西橡胶树参考序列的蛋白序列（XP_021668009.1）聚在一起，表明其正是橡胶树基因，其与大戟科植物木薯RPW8的亲缘关系最近，与蔷薇科植物桃（, XP_020423742.1）和草莓（subsp.，XP_011464442.1）RPW8的亲缘关系最远（图6）。

A：HbRPW8蛋白的保守结构域；
B：HbRPW8蛋白的二级结构预测；
C：HbRPW8蛋白的三级结构预测。

氨基酸序列一致性为100%用黑色标记，一致性≥75%用粉色标记，一致性>50%用蓝色标记。

2.4 HbRPW8启动子顺式作用元件分析

橡胶树启动子序列顺式作用元件预测分析显示（表2），启动子序列除了包含RNA聚合酶Ⅱ起始转录所必需的CAAT-box和TATA-box元件，还含有2个光响应元件（G-Box和GT1-motif）、4个植物激素响应相关元件（脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、赤霉素响应元件TATC-box和生长素响应元件TGA-element）、防御与应激元件（TC-rich repeats）及厌氧诱导调控元件（ARE）。分析结果表明基因的表达可能受光照和植物激素等条件的调控。

2.5 HbRPW8基因表达分析

由于基因启动子含有SA、ABA、GA等响应元件，因此，利用外源激素SA、ABA、GA、MeJA、ETH、IAA、H2O2和白粉菌对橡胶树芽接苗进行处理，分析基因对不同激素和生物胁迫处理的响应情况。结果如图7A～图7G所示，转录物能迅速被外源H2O2、SA和ETH诱导，并在处理后0.5 h达到最高水平，其相对表达量分别约为0 h对照的14倍、6倍和75倍，随着处理时间的延长该基因相对表达量有所降低，但仍显著高于对照。有趣的是，外源GA和ABA处理也迅速诱导了的表达，并在处理后0.5 h达到最高水平，但从2～24 h呈下降趋势。然而外源MeJA处理0.5 h和2 h该基因无显著表达，至6 h达到最高水平，是对照的10倍左右，随着处理时间的延长该基因相对表达量有所降低，但仍显著高于对照。相比之下，IAA处理后转录本显著下调。在24 h检测到最低表达水平，与对照相比降低了74%。说明H2O2、SA、ETH、GA和ABA均能迅速诱导的表达。

图6 不同植物RPW8氨基酸序列的系统进化树

表2 橡胶树HbRPW8基因启动子顺式作用元件分析

白粉菌侵染叶片后（图7H），以该基因在0 h的表达量为1，随着侵染时间的延长，3 h表达量达到最高点3.20，6 h稍微下降至1.23，12 h时上升至2.38，随后逐渐下降，24 h降为1.02，与最初0 h表达量基本相同，48 h和72 h显著下降，分别为0.31和0.23。分析白粉菌侵染后不同病害级数的叶片基因的相对表达量（图7I），结果显示基因在不同病级中均有表达。以该基因在0级的表达量为1，1级时相对表达量上升为9.28，2级缓慢下降为6.79，3级时达到最高，为9.89，4级显著下降为3.08，5级为0.22，说明白粉病菌侵染能够诱导基因的表达。

不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）

广谱抗病基因是植物抗病育种的宝贵资源，最初是在拟南芥中克隆得到，能对多种植物病害表现较高的抗性，尤其在白粉病抗性调控中起重要作用[13, 28]。本研究从橡胶树中克隆到1个基因，其具有典型的保守RPW8结构域，与木薯的遗传距离较近。橡胶树基因预测主要定位于细胞核中，这与的研究结果有一定相似性，定位于细胞核可以对白粉菌产生抗性，而定位于细胞质中的可以诱导细胞死亡却没有抗性[29]，表明可能对橡胶白粉病产生抗性。

水杨酸、茉莉酸和乙烯是植物抗病信号转导途径中重要的信号分子，且与其他植物激素信号存在交互作用[30-31]。本研究发现，基因启动子序列中含有水杨酸等激素信号分子相关的多种顺式作用元件，推测该基因参与激素信号分子调控，从而影响橡胶树抗白粉病。通过qRT-PCR检测发现，基因被白粉病菌强烈诱导表达，且随着时间的推移和病害等级的增加，其表达水平先上升后下降，与前人研究结果一致，即在病原体入侵前以低水平表达，但在感染的早期阶段被迅速诱导[32-33]。此外，在H2O2、SA、ETH、GA、ABA处理早期上调显著，在MeJA处理后期上调显著，且被白粉病菌侵染早期强烈诱导表达，推测该基因可能通过多种激素信号协同调控下游相关基因的表达来参与橡胶树对白粉病菌的抗性反应。目前已有许多研究证明，RPW8基因家族成员参与植物生物及非生物胁迫响应，如LAI等[34]克隆获得葡萄基因启动子，发现其受生物（疫霉菌）和非生物（高温、低温、SA）胁迫的响应；
ZOU等[35]研究表明FaNBS-RPW8融合蛋白在草莓感病品种中接种炭疽病菌后的不同阶段均被显著诱导。此外，在含有RPW8特征结构域的其他NBS-LRR类基因中也能响应多种胁迫，如郑永杰等[36]研究表明受樟树白粉病菌诱导表达，推测其可能参与了响应白粉病菌胁迫反应过程；
王雪[37]研究发现，和基因在黄瓜响应白粉病菌侵染中起作用，且可能与ABA、MeJA、SA、ETH、GA、活性氧等信号通路有关。WANG等[38]研究发现在白粉病菌侵染的西葫芦抗病品种中高表达，而在易感品种中不表达。在拟南芥中，RPW8蛋白主要通过SA通路和EDS1通路来调控拟南芥的抗白粉病反应[39]。研究还发现[40]和14-3-3λ（GF14lambda）[41]能正调控RPW8的抗性，肌醇磷酸神经酰胺合酶[42]、光敏色素相关蛋白磷酸酶2C型（）[43]及[44]是RPW8介导抗病性和细胞死亡的负调节因子。

综上所述，基因在植物响应各种胁迫中发挥重要作用，基因是否与拟南芥基因一样依靠SA通路起抗白粉病作用还未可知。在下一步研究中，可通过构建基因的过表达转基因植株或基因敲除突变体，进一步研究和验证基因在橡胶树抗白粉病过程中的功能。

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Cloning and Expression Analysis ofGene from

GUAN Xin1,2, TU Min2*, CAI Haibin1,2, WANG Yunyue1*, HU Yanshi2, ZENG Xia2

1. Plant Protection College, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China; 2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

(resistance to powdery mildew locus 8) is a broad-spectrum resistance gene locus to many plant diseases, especially powdery mildew. In this study, the cloning and expression analysis ofgene inwere carried out to lay the foundation for the analysis of powdery mildew resistance mechanism and molecular breeding.gene coding region (CDS) was cloned from rubber tree ‘Reyan 73397’ by RT-PCR. Bioinformatics analysis was carried out, and qRT-PCR method was used to determine the expression ofgene after seven hormones and powdery mildew infection at different times and disease grades. The full-length cDNA ofwas 570 bp, encoding 189 amino acids. The molecular weight of HbRPW8 was 21.73 kDa, the isoelectric point was 9.23, the fat coefficient was 86.30, and the total average hydrophilicity index was -0.404, which was a hydrophilic protein with eight phosphorylation sites. The protein was located in the nucleus without transmembrane domain and signal peptide, and had a conserved domain of RPW8. The main components of the secondary structure of HbRPW8 protein were α-helix and random coil, accounting for 70.90% and 22.22% of the amino acid sequence, respectively. Phylogenetic relationships analysis showed thatgene had the highest similarity with cassavagene. Hydrogen peroxide, salicylic acid, ethephon, gibberellin and abscisic acid could rapidly induce the expression oftranscript, and reached the highest level at 0.5 h after treatment, which was about 14, 6, 75, 2.5 and 4 folds of the control, respectively; methyl jasmonate treatment reached the highest level at 6 hafter treatment, about 10 times that of the control;transcript was significantly down-regulated after auxin treatment; with the increase of infection time and disease grade of powdery mildew, the expression level ofincreased first and then decreased. The results of this study preliminarily showed thatmay be involved in the resistance response mechanism of rubber tree, providing a reference for the study of rubber tree resistance breeding.

;gene; qRT-PCR; bioinformatics;

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.001

2022-03-11；

2022-04-14

国家重点研发计划项目（No. 2019YFD10005002-0303）；
农业农村部农垦局物种资源保护项目（No. 18200036）。

官 鑫（1997—），女，硕士研究生，研究方向：橡胶树抗病基因发掘。*通信作者（Corresponding author）：涂 敏（TU Min），E-mail：tm_tumin@163.com；
王云月（WANG Yunyue），E-mail：yunyuewang@hotmail.com。