植烟生态区、品种及其互作对烤烟多酚含量及品质的影响

陈燕 陈强 何轶 喻会平 郜军艺 赵二卫 陆引罡

（1贵州大学农学院，550025，贵州花溪；
2贵州大学烟草学院，550025，贵州花溪；
3贵州省烟草公司毕节市公司，551700，贵州毕节）

多酚（polyphenols）是一类独特的植物化学物质，是烟草重要的次生代谢产物和香气前体物质[1]。烟草中多酚类物质主要有咖啡单宁类（绿原酸）、香豆素类（莨菪亭、莨菪灵）和黄酮醇类（芸香苷、山奈酚糖苷）等，其中绿原酸和芸香苷是烟叶中主要的多酚类物质，占90%左右[2]。这些致香前体物质的合成和积累受光照[3]、温度[4]、品种[5]、施氮量[6]和栽培措施[7]等条件的影响。品种是决定烟叶风格和质量的内在因素，品种内含基因的表达方式和水平受环境影响，在烟草的生长过程中，生态条件和栽培措施通过影响烟叶化学成分和主要次生代谢产物的含量及比例，对烟叶品质产生重要影响[8]。

烟草品种是烟叶生产的物质基础，是提高烟叶质量的内因[9]。然而我国烟叶生产中依旧面临着品种种植单一的问题[10]。毕节烟区烟叶因具有独特的清香型[11]深受卷烟工业企业的青睐，近年来，毕节市烟叶产量实现了突破，但烟叶质量还有待同步提升，优质适产的矛盾依然存在。因此亟需引进适合毕节生态环境的新品种。云烟105和云烟116均由云南省烟草农业科学研究院选育，通过云南省烤烟品种审定委员会审定并在多个烟区推广种植[10-12]。本文以云烟105和云烟116为试验材料，研究2个品种在毕节地区2个典型生态烟区的烟叶多酚类物质含量及化学品质指标的差异，为毕节市烟叶新品种的应用及推广提供理论基础。

1.1 试验材料

云烟105和云烟116由毕节烟草公司提供。烤烟专用基肥[m(N):m(P2O5):m(K2O)=9:10:27]和专用追肥[m(N):m(P2O5):m(K2O)=13:0:26]的施用量分别为652和288.5kg/hm2。

贵州省毕节市大方县六龙科技园（105°42′22″E，27°9′5″N）海拔1448m，属北亚热带湿润季风气候，全年平均雾日为159.2d，占全年天数的43.6%，日照时数1311.2h，无霜期254～325d。土壤全氮1.31g/kg、碱解氮92.42mg/kg、有效磷22.14mg/kg、速效钾121.37mg/kg、有机质22.71g/kg、pH 6.53。贵州省毕节市威宁彝族回族苗族自治县黑石科技园（26°45′56″E，105°58′45″N）海拔 2220m，为高原气候，年均日照时数1800.0h，无霜期180d。土壤全氮1.07g/kg、碱解氮62.37mg/kg、有效磷11.85mg/kg、速效钾 77.71mg/kg、有机质 16.81g/kg、pH 6.12。贵州毕节大方和威宁的降雨、气温情况见表1。

表1 贵州省毕节市大方和威宁的降雨、气温Table 1 The rainfall,temperature of Dafang and Weining of Bijie city,Guizhou province

1.2 试验设计

采用二因素随机区组试验，设置4个处理，分别为大方生态区，云烟105（DF-105）；
大方生态区，云烟116（DF-116）；
威宁生态区，云烟105（WN-105）；
威宁生态区，云烟116（WN-116）。3次重复，每小区面积为67m2，行株距为110cm×55cm，种植密度为16 500株/hm2，纯N施用量为93.75kg/hm2，基追比为6:4，基肥于移栽前一天起垄时施入，追肥于移栽15d后随水施入烟株根部。同一区组内随机排列，小区及区组间设置保护行和走道，试验期间，各处理小区烟苗移栽、灌溉、中耕除草及病虫害防治措施管理均按照当地优质烟叶生产管理方式进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 多酚 各处理选取外观质量均匀一致的初烤烟叶（C3F），去梗切丝后在40℃下干燥12h，研磨过40目筛，密封置于冰箱中（-10℃）。参照烟草行业标准YC/T 202-2006[13]测定多酚类化合物含量。高效液相色谱（美国Agilent公司，Agilent 1260）分析，流动相 A：V水:V甲醇:V乙酸=88:10:2；
流动相 B：V水:V甲醇:V乙酸=10:88:2，流动相 C：100%甲醇。

柱温30℃，柱流量1mL/min，进样体积10μL。梯度：0min，100%A；
16.5min，80%A+20%B；
30min，20%A+80%B；
34min，100%C。检测波长340nm，参比波长480nm，分析时间约为40min。用新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭和芸香苷标准品制作标准曲线，外标法计算样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和总酚（以样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭和芸香苷含量的总和计为总酚）含量。

1.3.2 常规化学品质指标 各处理选取外观质量均匀一致的初烤烟叶（C3F），在55℃烘至恒重，研磨过40目筛，装入自封袋备用。用H2SO4-H2O2消化法测定烟叶氮、磷和钾含量，用3，5-二硝基水杨酸比色法测定烟叶还原性糖和总糖含量，用紫外分光光度法测定烟叶烟碱含量。

1.4 数据处理

采用 Office Excel 2016、DPS 7.05及 Origin 2018进行统计分析与图形制作，采用Duncan法进行多重比较（P＜0.05）。

2.1 不同生态区烟叶多酚含量的差异分析

如图1所示，5种多酚物质峰形和分离效果均较好。对2个生态区烤后烟叶的多酚类物质含量进行方差分析，结果（表2）表明，植烟生态区之间烤烟多酚类物质含量差异较大，除隐绿原酸和芸香苷未达显著差异水平外，新绿原酸、绿原酸、莨菪亭及总酚含量均达到显著差异水平。其中大方地区新绿原酸（2.26mg/g）、绿原酸（13.37mg/g）和总酚（24.93mg/g）含量均显著高于威宁地区；
而莨菪亭含量与之相反。

图1 多酚标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of polyphenol standard

表2 不同生态区间多酚类物质含量Table 2 The contents of polyphenols in different ecological intervals mg/g

2.2 不同品种间烟叶多酚含量的差异分析

对2个品种烤后烟叶的多酚类物质含量进行方差分析，结果（表3）表明，不同品种间烤烟多酚类物质含量差异较大。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芸香苷及总酚含量均以云烟105更高，分别为2.36、14.49、2.95、7.10和27.21mg/g，显著高于云烟116，2个烟草品种莨菪亭的含量均为0.30mg/g。

表3 不同品种间多酚类物质含量Table 3 The content of polyphenols among different varieties mg/g

2.3 不同处理间烟叶多酚含量的差异分析

对不同处理间烤后烟叶的多酚物质含量进行方差分析（图2），植烟生态区与品种各组合间多酚类物质含量差异显著，其中以大方地区与云烟105组合的新绿原酸（2.58mg/g）、绿原酸（16.35mg/g）、隐绿原酸（3.19mg/g）和总酚（29.64mg/g）的含量均显著高于其他组合；
新绿原酸和隐绿原酸含量均表现为DF-105＞WN-105＞DF-116、WN-116，绿原酸和总酚含量均表现为DF-105＞WN-105＞WN-116＞DF-116，差异显著。而莨菪亭含量以WN-116处理最大，为0.35mg/g，其次为WN-105处理，DF-116处理最低，仅为0.24mg/g。DF-105处理的芸香苷的含量最大，为7.26mg/g，DF-116处理的芸香苷含量最低，仅为5.40mg/g，显著低于其他组合。

图2 不同处理间烟叶多酚含量差异分析Fig.2 Difference analysis of polyphenol contents in tobacco leaves among different treatments

2.4 不同生态区及品种对烟叶多酚类物质含量贡献率的分析

对不同植烟生态区与品种及其互作对烤烟多酚类物质含量的方差分析（表4）表明，烟叶多酚类物质含量显著受植烟生态区、烤烟品种及生态区与品种间交互作用的影响。品种对新绿原酸的含量贡献率最大，占总变异的68.53%，其次为生态区的贡献率，为22.68%，生态区与品种的交互最低，仅为8.79%。品种对绿原酸的含量贡献率最大，占总变异的60.91%，生态区与品种的交互次之，占总变异的31.41%，生态区影响最小，仅为7.68%。品种对隐绿原酸含量的贡献率最大，为82.39%，其次为生态区，占总变异的9.67%，生态区与品种的交互最低，仅为7.94%。生态区对莨菪亭含量的贡献率最大，占总变异的的94.40%，而品种及品种与生态区的交互对莨菪亭的影响未达到显著差异水平。品种对芸香苷含量的贡献率最大，占总变异率的63.10%，生态区与品种的交互次之，占总变异的27.42%，生态区影响最小，仅为9.48%。品种对总酚的含量贡献率最大，占总变异率的69.34%，生态区与品种的交互次之，占总变异的27.52%，生态区影响最小，仅为3.14%。

表4 生态区与品种对烤烟多酚类物质影响的双因素方差分析Table 4 Two-factor analysis of variance for the effects of interaction between ecoregions and varieties on polyphenols in flue-cured tobacco

2.5 不同生态区及不同品种烤烟多酚类物质主成分分析

基于多酚类物质含量的烟叶样品进行主成分分析，前2个主成分（品种和地区因素）分别为69.7%和25.7%，取第1、2个主成分得分作图来表征不同处理烟叶多酚含量（图3）。4个组合烤烟分布在不同的区域，处理间样品离散型较大。品种间多酚类物质含量主要表现在PC1上，即云烟105与PC1呈正相关，而云烟116与PC1呈负相关。不同植烟生态区多酚类物质含量主要表现在PC2上，即大方地区与PC2呈负相关，而威宁地区则与PC2呈正相关。

图3 不同生态区及不同品种烤烟多酚类物质主成分分析Fig.3 Principal component analysis of polyphenols in different varieties of flue-cured tobacco in different ecological regions

2.6 不同生态区及不同品种烤后烟叶常规化学品质分析

由表5可知，各组合烤烟常规化学品质指标处于优质烟叶范围，威宁地区烟叶含氮量显著高于大方地区，2个品种间无显著差异。磷含量以DF-105处理最高，为0.22%，烟叶钾、还原糖和总糖含量整体表现为云烟105＞云烟116，大方地区＞威宁地区，均以DF-105处理最高。云烟116烟碱含量显著高于云烟105，以DF-116含量最高，为2.51%，DF-105烟碱含量最低，仅为1.81%，显著低于其他处理。

表5 各处理烟株烤后烟叶常规化学品质Table 5 Conventional chemical quality of flue-cured tobacco leaves in different treatments %

2.7 不同生态区及不同品种烤烟烟叶各品质指标间的相关性分析

对不同生态区和不同品种烤烟叶片多酚类物质含量及常规化学品质指标进行相关性分析（图4）可知，新绿原酸、总酚、钾、绿原酸、隐绿原酸、总糖、还原糖和芸香苷的含量呈显著正相关关系；
烟叶磷含量仅与钾、总糖含量呈显著正相关，与莨菪亭呈显著负相关关系；
烟叶氮含量则与莨菪亭含量呈显著正相关关系；
烟碱含量与磷、莨菪亭和氮含量相关性未达显著水平，与其余各指标间均呈显著负相关关系。

图4 各处理烟株烟叶各品质指标间相关性分析Fig.4 Correlation analysis among various quality indexes of tobacco leaves in different treatments

绿原酸是烟草中含量最高的多酚化合物，也是仅有的单宁类物质[14]。绿原酸不仅影响烟草的生长发育，对烟叶香吃味、调制特性及色泽等也有重要影响[15]，提高烟草中新绿原酸和绿原酸含量可显著提高烟叶整体的感官质量[16]。生态因子及烤烟品种均是影响烟叶中3种绿原酸异构体含量的重要影响因素。本研究表明，大方植烟生态区中部烟叶绿原酸含量显著高于威宁地区，威宁处于高海拔地区，UV-B（中波紫外线辐射，波长为280～320nm）更多，UV-B辐射上升造成多酚氧化酶和过氧化物酶含量升高，使中部烟叶多酚氧化分解[17-18]；
品种对3种绿原酸异构体的贡献率均在60%以上，这与孙志浩等[19]的研究结果一致。可见，品种的遗传特性是决定烟叶绿原酸含量的主导因素。

莨菪亭是烟草多酚类物质的重要组成因素之一，本研究表明，云烟105和云烟116间莨菪亭含量无显著差异，植烟区生态环境的差异是造成2个品种莨菪亭含量变化的主导因素，因此选择适宜的生长环境更有利于调控莨菪亭含量。

芸香苷属于类黄酮，具有由苯甲酰共轭体系和肉桂酰共轭体系组成的交叉共轭体系，其越大，紫外吸收能力越强，对紫外光的吸收范围较宽[20-21]。Bilger等[22]研究表明，温度是植物表皮紫外线透过率的决定因素，低温有利于多酚（特别是芸香苷）的生物合成，紫外辐射和低温均会引起植物芸香苷含量的增加[23]。因此威宁生态区的生态特点更有利于促进芸香苷的合成和积累。本研究表明，云烟116的芸香苷含量表现为威宁地区高于大方地区，但2个生态区间云烟105芸香苷的含量无显著差异。而王育军等[24]在对NC102和NC297的研究中表明，在1700～2200m内，随海拔升高，芸香苷含量逐渐下降。可见，不同品种对不同植烟生态区的适应情况不同。

本研究对烟叶常规化学指标及多酚类物质含量的相关性分析表明，烟叶常规化学指标与多酚类物质关系密不可分，其中烟叶还原糖和水溶性总糖与多酚类物质呈显著正相关关系，这与姜慧娟等[25]的研究结果一致，可能与烟草中多酚通常以糖苷或酯形式存在有关[26]。研究[27]表明，多酚类物质在高糖类群烟叶内表现较为稳定，而在低糖类群烟叶内稳定性较差。毕淑峰等[28]对云南烤烟评吸质量与化学成分的关系研究认为，烟碱与香气质、余味、杂气和刺激性分值呈显著或极显著负相关，与浓度分值呈显著正相关。李文卿等[29]研究表明，在一定范围内随烟碱含量的增加，多酚含量呈逐渐降低趋势，本试验也得出相似的结论。

本研究结果表明，烟叶中多酚类物质含量在不同植烟生态区和品种间的差距均达到显著差异水平，其中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸和芸香苷含量主要受品种影响最大，而莨菪亭则受植烟生态区的影响更大，其中云烟105在大方生态烟区的绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸和芸香苷含量更高，而云烟116在威宁生态烟区的莨菪亭含量更高；
烟叶磷、钾、还原糖及总糖含量与多酚类物质含量呈显著正相关关系，烟碱含量则与多酚类物质含量呈显著负相关关系。综合烟叶多酚及化学成分来看，毕节新引品种云烟105和云烟116更适宜种植在大方地区，且云烟105表现优于云烟116。