联合环介导等温扩增和横向流动试纸条可视化检测副猪嗜血杆菌

广 敏 靳洪振 彭康尧 李华明 项 维 陈瑞格 雷连成，2* 张付贤*

(1.长江大学 动物科学学院，湖北 荆州 434023;2.吉林大学 动物医学学院，长春 130062)

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起的一种猪全身性疾病，感染该病的猪以脑膜炎、心包炎、纤维素性多发性关节炎、多发性浆膜炎为主要特征[1]；
不同阶段猪群均对其易感，其中对断奶前后和保育期的仔猪危害最为严重，是我国养猪业的重要细菌性疾病之一[2]。副猪嗜血杆菌可分为15个血清型，不同血清型菌株之间毒力存在显著差异，且各血清型之间交叉保护力弱，导致疫苗的免疫效果差[3]。随着规模化养殖密度的增加，副猪嗜血杆菌感染以及与其他病原混合感染多发，是导致仔猪群死亡率上升的重要原因[4]，严重阻碍了我国养猪业的发展。

目前针对副猪嗜血杆菌的检测方法主要有：细菌学分离鉴定[5]、血清学检测方法[6]、分子生物学检测方法及包括PCR[7]、实时荧光定量PCR[8]、数字PCR[9]、原位杂交(ISH)[10]等多种方法[11]，但这些方法均适用于实验室检测，且对设备依赖性高，不适合即时、临场检测。日本学者Notimi于2000年发明的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种适用于病原学诊断的恒温扩增技术，该方法利用4条特异性引物识别靶DNA中的6个片段，结合具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在恒定温度下即可完成靶DNA的特异性扩增[12]，具有简便、快速、灵敏和特异性高等特点。LAMP反应在基因扩增方面具有很大优势，已在世界范围内广泛传播，并成功应用于分子检测和诊断[13]。目前用来判定LAMP扩增结果的方法主要有：焦磷酸镁沉淀、染料法[14]、琼脂糖凝胶电泳[15]、实时荧光定量法[16]和浊度法[17]，前2种判定方式存在因结果差异不明显而造成观察不便捷以及误判等问题，而后3种判定方式则需要昂贵的实验室设备，也无法完成即时检测。因此，亟需建立一种简单快速、准确有效的副猪嗜血杆菌可视化诊断方法应用于临场和快速检测。

目前，LAMP-LFD技术已成功应用于乙型肝炎病毒、绵羊肺炎支原体等病原的检测[18-20]，但对副猪嗜血杆菌的LAMP-LFD检测尚未见报道。本研究旨在建立一种适用于基层副猪嗜血杆菌临场检测的快速方法，实现副猪嗜血杆菌的可视化、便捷化鉴别。

1.1 试验菌株与试剂

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，PM)、猪链球菌(Streptococcussuis，SS)、猪沙门氏菌(Salmonellosis，SAL)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae，KP)均由长江大学动物科学学院动物重要病原生物学实验室保存；
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)由吉林大学动物医学学院雷连成教授课题组惠赠。

细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司，2× M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(with blue dye)、标准分子量DL2000 Marker购自北京聚合美生物科技有限公司，6× loading buffer、Bst DNA聚合酶、10× ThermoPol Buffer、MgSO4、dNTPs均购自Vazyme Biotech Co公司，DEPC水购自Biosharp，染料购自北京凯莱酶新业生物科技有限公司。

1.2 临床样品

采集2020—2022年间来自河南漯河、驻马店、南阳等规模化生猪养殖场的临床样品52份(猪口鼻拭子23份、胸腔积液8份、肺脏组织样品21份)。

1.3 基因组DNA提取

按照天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组，提取的基因组DNA测定浓度，并在-20 ℃保存。

1.4 LAMP引物设计与合成

根据Gen Bank中已发表的infB序列，采用Blast获得高度保守区域。针对保守区域序列，参考LAMP引物设计原则，使用Primer Explorer V5软件(http:∥primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计5组LAMP引物，每组引物针对6个特定区域，设计出4条特异性引物F3、B3、FIP和BIP；
选取其中高特异性引物组进行试验。将最终选取的引物FIP和BIP的5′末端分别用Biotin和6-FAM进行标记，上述引物和修饰引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LAMP引物序列信息如表1所示。

表1 副猪嗜血杆菌inf B基因的LAMP引物信息Table 1 LAMP primer information of inf B gene of Haemophilus parasuis

图1 副猪嗜血杆菌LAMP引物在inf B基因序列的位置Fig.1 Location of LAMP primers of Haemophilus parasuis in inf B gene sequence

1.5 副猪嗜血杆菌LAMP反应体系的建立

提取的副猪嗜血杆菌基因组DNA作为阳性模板，DEPC水作为阴性对照。总反应体系为25 μL，扩增反应体系包括10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol/L) 1.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 3.5 μL，内引物FIP、BIP (10 mmol/L) 4 μL，外引物F3、B3 (100 mmol/L) 0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，甜菜碱2 μL，模板2 μL，DEPC水补足至25 μL，将反应物置于反应管中，于65 ℃恒温反应60 min。

1.6 副猪嗜血杆菌LAMP反应体系和条件优化

1.6.1LAMP引物比的优化

保持其他条件不变，使内外引物浓度比(F3∶FIP和B3∶BIP)分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，分别进行LAMP反应，反应结束后通过比较琼脂糖凝胶电泳结果，选出最佳内外引物比。

1.6.2MgSO4浓度的优化

保持其他条件不变，将反应体系中加入MgSO4的体积分别变为0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μL，以MgSO4终浓度梯度0、2、4、6、8和10 mmol/L分别进行LAMP反应，反应结束后通过比较琼脂糖凝胶电泳结果，选出最佳MgSO4浓度。

1.6.3dNTPs浓度的优化

保持其他条件不变，将反应体系中加入dNTPs的量分别变为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0 μL，以dNTPs终浓度梯度1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 mmol/L进行LAMP反应，反应结束后通过比较琼脂糖凝胶电泳结果，选出最适宜的dNTPs浓度。

1.6.4反应温度的优化

按上述优化好的反应体系进行反应，分别设定反应温度为60～67 ℃温度梯度，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，通过比较选出最佳反应温度。

1.6.5反应时间的优化

按上述优化好的反应体系和反应温度下进行反应时间的优化，分别设定反应时间为15、30、45和60 min，反应产物通过琼脂糖凝胶电泳筛选出最优反应时间。

1.7 副猪嗜血杆菌LAMP-LFD方法的建立

将5 μL LAMP扩增产物加入100 μL缓冲液中，混匀，将混合物加入试纸条上的样品垫中，静置5 min后判定试验结果。观察LFD试纸条的T线和C线的颜色变化，若T、C线均显示为红色，判定为阳性；
若只有C线显红色，则判定为阴性；
若T、C线均无色，则为无效。判断标准如图2。

(a)阳性；
(b)阴性；
(c)无效(a) Positive；

(b) Negative；

(c) Invalid

1.8 副猪嗜血杆菌LAMP-LFD检测方法的特异性

分别以副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌基因组为模板，按照已建立的LAMP方法对其进行检测，反应结束后LAMP扩增产物分别通过琼脂糖凝胶电泳法与LFD进行分析。

1.9 副猪嗜血杆菌LAMP-LFD检测方法的灵敏度

将提取的副猪嗜血杆菌基因组以紫外分光光度计测定浓度，并用DEPC水进行10倍梯度稀释。分别以不同浓度的基因组作为模板，反应结束后LAMP扩增产物分别通过琼脂糖凝胶电泳法与LFD进行分析，同时以不同浓度的基因组DNA为模板，进行常规PCR检测，对比3种检测方法的灵敏度。PCR引物F3:TATGGCGGAAGGCGATGT，B3:TGCACGGACGTTAAAGCC，目的片段长度为211 bp；
反应程序为94 ℃预变性3 min；
95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；
72 ℃延伸5 min。

1.10 副猪嗜血杆菌LAMP-LFD检测方法的重复性试验

取30份已知病原结果的猪临床样品，平均分为3组，每组10份(副猪嗜血杆菌样品2份、猪链球菌样品1份、肺炎克雷伯菌样品1份、沙门氏菌样品1份、胸膜肺炎放线杆菌样品1份、巴氏杆菌样品1份和阴性样品3份)。按照天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组，分3批次应用建立的LAMP-LFD方法检测这些样品，根据检测结果统计批内和批间变异系数，评估该方法的重复性。

1.11 副猪嗜血杆菌临床样品的检测

对采集的52份猪临床样品(猪口鼻拭子23份、胸腔积液8份、肺脏组织样品21份)分别进行普通PCR、LAMP和LAMP-LFD检测，比较3种方法的检出率，评估建立的LAMP-LFD方法在临床检测上的适用性。

2.1 副猪嗜血杆菌LAMP引物筛选

将本研究设计的5组引物进行LAMP检测，检测结果如图3所示。引物组1～5阴性均没有扩增，阳性均出现了扩增曲线。引物组1于反应18 min时最先出现上升趋势，30 min后反应进入平缓期；
引物组2和5于反应后20 min出现扩增；
引物组3和4于反应后30 min才出现扩增，且引物组1较其他引物组扩增效率最高。因此，选择引物组1作为副猪嗜血杆菌LAMP法检测的最适引物组。

图3 副猪嗜血杆菌LAMP引物筛选Fig.3 Screening of LAMP primers forHaemophilus parasuis

2.2 副猪嗜血杆菌LAMP检测体系确立

LAMP检测副猪嗜血杆菌采用控制变量法分别进行内外引物浓度比、MgSO4浓度、dNTPs浓度、反应温度、反应时间优化。结果如图4所示，内外引物浓度比(F3∶FIP和B3∶BIP)为1∶8时，扩增产物出现明亮、清晰的条带(图4(a))；
MgSO4终浓度在4 mmol/L时，扩增产物能够出现典型的梯状条带，终浓度为6 mmol/L时扩增产物的条带最亮(图4(b))；
dNTPs在1 mmol/L时，扩增产物即可出现梯状条带，终浓度为1.8 mmol/L时的条带最清晰、明显(图4(c))；
当反应温度在61 ℃左右时，扩增产物即可出现典型的梯状条带，在66 ℃左右时反应体系扩增产物的梯形条带最为明显(图4(d))；
当反应时间过短时，反应体系没有梯形条带产生，当反应时间在30 min及其以上时，扩增产物趋于稳定，电泳产生的梯形条带清晰且明亮(图4(e))。因此，最佳检测体系为：10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol/L) 1.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 4.5 μL，内引物FIP、BIP (10 mmol/L) 4 μL，外引物F3、B3 (10 mmol/L) 0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，甜菜碱2 μL，模板2 μL，DEPC水补足至25 μL。

(a)内外引物浓度比：M，DL 2 000 DNA Marker；
1～6引物浓度比分别为1∶1；
1∶2；
1∶4；
1∶6；
1∶8；
1∶10；
7为阴性；
(b)MgSO4浓度：M，DL 2 000 DNA Marker；
1～6 MgSO4浓度分别为0、2、4、6、8和10 mmol/L；
(c)dNTPs浓度：M，DL 2 000 DNA Marker；
1～9 dNTPs浓度分别为0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 mmol/L；
(d)LAMP反应温度：M，DL 2 000 DNA Marker；
1～8分别为67.0、66.5、65.6、64.3、62.7、61.4、60.5和60.0 ℃；
(e)反应时间：M，DL 2 000 DNA Marker；
1～4分别为15、30、45和60 min；
5为阴性。(a) Concentration ratio of internal and external primers: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-6 primer concentration ratios are 1∶1; 1∶2; 1∶4; 1∶6; 1∶8; 1∶10; 7 is negative; (b) MgSO4 concentration: M. DL 2 000 DNA Marker; the concentrations of 1-6 MgSO4 are 0, 2, 4, 6, 8 and 10 mmol/L, respectively; (c) dNTPs concentration: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-9 dNTPs concentrations are 0, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2 and 2.4 mmol/L, respectively; (d) LAMP reaction temperature: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-8 are 67.0, 66.5, 65.6, 64.3, 62.7, 61.4, 60.5, and 60.0 ℃, respectively; (e) Reaction time: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-4 are 15, 30, 45 and 60 min, 5 is negative.

2.3 副猪嗜血杆菌LAMP-LFD检测的特异性分析

利用建立的副猪嗜血杆菌LAMP-LFD检测方法对猪常见病原菌：猪链球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌进行特异性检测。结果如图5(a)所示，以副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板的LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中出现特异性梯形条带；
而猪链球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和巴氏杆菌基因组DNA的LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中均无梯状条带。LFD检测副猪嗜血杆菌的LAMP产物，T线和C线同时显色，判定为阳性；
LFD检测其他病原菌时，仅C线显示红色条带，T线无颜色变化，均为阴性(图5(b))。LAMP与LAMP-LFD检测病原的结果一致，如表2所示。结果表明，本研究所设计的副猪嗜血杆菌LAMP引物具有良好的特异性，与其他病原菌无交叉反应，可特异识别副猪嗜血杆菌。

表2 副猪嗜血杆菌不同检测方法特异性分析Table 2 Specificity analysis of different detection methods of Haemophilus parasuis

(a)LAMP特异性结果：M，DL 2 000 DNA Marker；
1～7分别表示阴性、APP、PM、SS、SAL、KP、HPS；
(b)LAMP-LFD 特异性结果：1～7分别表示阴性、APP、PM、SS、SAL、KP、HPS。(a) LAMP specific results: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-7 shows negative, APP, PM, SS, SAL, KP and HPS; (b) LAMP-LFD specific results: 1-7 are Negative, APP, PM, SS, SAL, KP and HPS, respectively.

2.4 副猪嗜血杆菌LAMP-LFD检测的灵敏度

紫外分光光度计测定提取的副猪嗜血杆菌基因组DNA的浓度为128.5 ng/μL，按照10倍倍比稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和10-11，以LAMP扩增，LAMP扩增产物分别通过琼脂糖凝胶电泳法与LFD、PCR进行比较分析。结果显示(图6)，当DNA稀释至10-8时，常规PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中无特异性条带产生；
当DNA稀释至10-10时，LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中均显示有梯形条带产生，在横向流动试纸条上均出现T线和C线2条带，阴性对照显示质控线一条带；
LAMP方法和LAMP-LFD方法的最低检测限均为1.285×10-12ng/μL。统计3种方法的最低检测浓度，结果如表3所示，常规PCR法的最低检测限为1.285×10-9ng/μL，LAMP和LAMP-LFD的检测结果一致，最低检测限均为1.285×10-12ng/μL，较常规PCR检测方法灵敏度提高103倍，表明建立的副猪嗜血杆菌LAMP-LFD可视化检测方法较常规PCR具有较高的灵敏度。

(a)PCR灵敏度结果：M，DL 2 000 DNA Marker；
1为阴性；
2～11为HPS基因组稀释浓度分别为1.285×10-1～1.285×10-10 ng/μL；
(b)LAMP灵敏度结果：M，DL 2 000 DNA Marker；
1为阴性，2～12为HPS基因组稀释浓度分别为1.285×10-1～1.285×10-11 ng/μL；
(c)LAMP-LFD灵敏度结果：1为阴性；
2～11为HPS基因组稀释浓度分别为1.285×10-1～1.285×10-11 ng/μL。(a) PCR sensitivity result: M. DL 2 000 DNA Marker; 1 is negative; 2-11 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-10 ng/μL, respectively; (b) LAMP sensitivity results: M. DL 2 000 DNA Marker; 1 is negative; 2-12 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-11 ng/μL, respectively; (c) LAMP-LFD sensitivity results: 1 is negative, 2-11 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-11 ng/μL, respectively.

表3 副猪嗜血杆菌不同检测方法灵敏度分析Table 3 Sensitivity analysis of different detection methods for Haemophilus parasuis

2.5 副猪嗜血杆菌LAMP-LFD检测方法的重复性试验

应用临床样品分批次验证建立的LAMP-LFD方法的重复性，结果发现，3批次建立的LAMP-LFD方法能够准确检测到临床样品中的副猪嗜血杆菌感染样品，且不会与其他细菌产生交叉反应，检测结果与常规细菌培养鉴定方法结果一致，表明本研究建立的LAMP-LFD检测方法具有良好的重复性。

2.6 副猪嗜血杆菌临床样品的检测

从河南漯河、驻马店、南阳等规模化生猪养殖场采集52份临床样品，提取基因组作为模板进行常规PCR、LAMP和LAMP-LFD可视化检测。结果如表4所示，52份样品中，常规PCR法检测出9份副猪嗜血杆菌阳性样品，阳性率为17.3%；
LAMP和LAMP-LFD法均检出10份副猪嗜血杆菌阳性样品，阳性率为19.2%，两者的检测结果一致，符合率为100%。研究结果进一步表明，本研究建立的副猪嗜血杆菌LAMP-LFD可视化检测方法可用于临床副猪嗜血杆菌感染样品的检测，且灵敏度高于常规PCR方法。

表4 副猪嗜血杆菌临床样本检测分析Table 4 Detection analysis of clinical samples of Haemophilus parasuis

目前，副猪嗜血杆菌病存在于主要养猪的国家，随着养猪业发展，副猪嗜血杆菌病已成为影响养猪业的重要细菌病之一[21]。研究表明，当前副猪嗜血杆菌病发生呈递增趋势，与大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌等细菌和猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒混合感染影响各个阶段的生猪，加上多重耐药菌株的出现，给养猪业造成了严重的经济损失[22]。结合规模化、集约化生猪养殖生产的需求，临床上亟需副猪嗜血杆菌等病原的快速、灵敏、便捷的临场检测方法。

Kiatpathomchai等[23]在2008年将环介导等温扩增技术(LAMP)和横向流动技术(LFD)结合用于病原的检测。LAMP的产物可在横向流动试纸条上5 min内以显色的方式呈现，通过肉眼即可快速判定试验结果；
该方法消除了对仪器设备的依赖，节省了检测成本与时间，也避免了与溴化乙锭(EtBr)的接触，非常适用于即时检测。本研究将副猪嗜血杆菌的LAMP恒温扩增方法与LFD检测方法相结合，建立了副猪嗜血杆菌的LAMP-LFD检测方法，实现了对副猪嗜血杆菌的快速、灵敏、可视化检测。在引物设计上，本研究同时针对副猪嗜血杆菌不同基因保守核酸序列设计特异性引物用于LAMP扩增，经筛选发现针对infB基因的1个引物组在灵敏度、特异性上都具有良好的性能，能够实现对副猪嗜血杆菌基因的特异性识别和扩增。同时，通过在内引物FIP和BIP的5′末端分别添加Biotin和6-FAM进行标记，使得副猪嗜血杆菌LAMP反应产物具备了与LFD结合显色的能力；
经验证副猪嗜血杆菌扩增产物能有效地与LFD结合，且整个反应过程加显色只需35 min即可判断结果。陈欢等[24]建立的应用于金黄色葡萄球菌检测的LAMP-LFD法，检测时间只需35 min；
刘露等[25]建立的检测草鱼呼肠孤病毒LAMP-LFD法，检测时间在50 min左右，总体来讲，本研究针对副猪嗜血杆菌的LAMP-LFD具有快速、便捷的优势。同时，我们对建立的LAMP-LFD检测特异性进行测定，发现所设计的副猪嗜血杆菌LAMP引物具有良好的特异性，未检测到与其他病原菌发生交叉反应；
在灵敏度上，LAMP-LFD检测副猪嗜血杆菌的灵敏度较常规PCR高103倍，这与LAMP-LFD在猪支原体肺炎、羊口疮病毒等病原的检测中表现出的灵敏度相一致[26-27]；
应用临床样品分批次验证建立的LAMP-LFD方法的重复性，不同批次的LAMP-LFD均能有效的重复检测结果，且与常规细菌培养鉴定方法结果一致；
进一步将LAMP-LFD可视化检测方法用于临床副猪嗜血杆菌感染样品的检测，验证了本研究建立的LAMP-LFD方法能够高灵敏、特异性地检测临床副猪嗜血杆菌感染样品，具有较好的重复性和准确性，适用于基层养殖企业临场、便捷检测。

LAMP反应需要多对引物，容易产生引物二聚体；
引物设计上对靶序列和引物的长度要求高，且由于该方法灵敏度高，在琼脂糖凝胶电泳过程中由于加样、EP管的开盖、气溶胶的形成等极易发生污染，导致假阳性的结果[28-29]。这些存在的问题需要通过对操作人员的规范培训及通过加入某些LAMP辅助剂进行克服改进。本研究将LAMP与LFD结合，在实际操作中省去了琼脂糖凝胶电泳的步骤，节省了检测时间，可代替琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行可视化判读[30]。

本研究基于环介导等温扩增和横向流动试纸条技术成功建立了副猪嗜血杆菌的可视化检测方法，LAMP方法实现了对副猪嗜血杆菌infB基因的特异性检测，结合横向流动试纸条使LAMP扩增产物的检测可视化；
LAMP结合LFD的副猪嗜血杆菌检测方法具有高特异性、高灵敏度、操作简单、不依赖仪器设备等特点，结果判定明显直观，适用于基层使用和推广。