GRK6在恶性肿瘤中的研究进展

梁心怡，杜润蕾

（武汉大学 生命科学学院，湖北武汉 430072）

G蛋白偶联受体激酶家族（G protein-coupled receptor kinase，GRKs）由7个序列结构同源并且功能相似的丝氨酸/苏氨酸激酶组成。家族成员最初由于具有能够特异性识别和磷酸化与激动剂结合后活化的G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor，GPCR）并使其脱敏的作用而被鉴别和命名[1]，是负调节GPCR活性的关键激酶。GPCR是细胞中最多且影响最为广泛的跨膜信号蛋白，从光和气味等感觉刺激，到神经递质、趋化因子、激素、脂质、多肽和离子等各种细胞外的刺激都能够由不同种类的GPCR接收再传递到细胞内，通过与下游不同的G蛋白发生作用，调控细胞内一系列生理病理反应的发生[2]。GPCR的失调与多种疾病的发生，如高血压、过敏、神经系统疾病甚至癌症等都有着密切的联系。目前在全世界所有上市药物中，各类GPCR的靶向药物约占35%[3]，因此作为唯一能够负调控GPCR发生同源脱敏作用的激酶，GRKs在成为新的药物作用靶点上具有极大的潜力和研究前景。近年来，多项研究发现GRK家族中的成员GRK6在恶性肿瘤中的表达与正常组织有明显的差异，并且与肿瘤的生长、增殖和迁移侵袭能力有着密切的联系。本文将围绕GRK6对体内生理病理过程的调控作用及其在各类型肿瘤中的相关研究进行综述，为未来进一步揭示GRK6与恶性肿瘤发生发展之间的关系提供理论基础。

根据基因结构和序列的相似性，GRK家族中可再细分成GRK1亚家族（GRK1、GRK7）、GRK2亚家族（GRK2、GRK3）和GRK4亚家族（GRK4、GRK5、GRK6）3个亚家族。GRK6最初于1993年从人类心脏cDNA文库中分离并被鉴定为G蛋白偶联受体激酶的新亚型[1]。GRK6属于GRK4亚家族，它在人体各组织中都普遍表达，其中淋巴组织和骨髓中的表达量最高。GRK6基因在人类5号染色体上，由16个外显子组成，在各物种中都高度保守，通过对羧基末端16号外显子的可变剪切共产生了3种剪接体，分别为GRK6A、GRK6B和GRK6C，并且在人、小鼠和大鼠中都普遍存在[4]。GRK6蛋白具有多个结构域（见图1），其中有3个结构域[由约20个高度保守的氨基酸残基组成的N端结构域，G蛋白信号同源域（Regulator of G protein signaling homology domain，RH）和处于蛋白中心位置的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域（Kinase Domain，KD）]在GRK6的不同转录本中都普遍存在，而且为GRK家族蛋白共有[5]。GRK6 N末端结构域能通过与细胞膜中的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）相互作用，促进蛋白靶向定位到细胞膜上并发生自磷酸化增强自身激酶活性[6]。GRK6的活性构象相对于自由构象较为封闭，其N端20个高度保守的氨基酸残基会呈有序排列并形成一个α螺旋结构，与激酶结构域的C端和小叶区域发生相互作用形成受体对接位点[7]，因此这一构象对于GRK6识别和磷酸化活化的GPCR功能的实现至关重要。GRK6激酶属于AGC激酶家族，其激酶结构域具有AGC激酶家族的丝氨酸/苏氨蛋白激酶的结构和功能特征，而RH结构域则充当了激酶小叶的支架，使其能够维持磷酸化活化GPCR的构象[5]。此外，GRK6的C端含有一段棕榈酰化位点（C561，C562，C565），也与膜定位相关，基因转录翻译后的棕榈酰化修饰能够促进蛋白与膜结合，而去棕榈化修饰后的GRK6则更倾向于定位在细胞质和细胞核中[4-6]。

图1 GRK6结构域示意图[4,7]

GRK6能特异性地与多种GPCR或非GPCR蛋白发生相互作用，参与调控体内重要的细胞信号通路传导与生理过程，并且与一些疾病的发生有着密切的联系，目前的研究较多集中于心脑血管、免疫系统以及神经系统疾病中。GRK6能够通过磷酸化介导人和小鼠血小板表面的多种GPCR产生脱敏作用，包括凝血酶受体PAR1、PAR4以及嘌呤能受体P2Y1、P2Y12，阻断了对凝血酶和ADP刺激的响应，负调控血小板的活化聚集，从而抑制了止血作用和血栓的形成，因此GRK6对于心脏病、中风等血栓性心脑血管疾病而言是一个潜在的治疗靶点[8-10]。

研究发现，在免疫系统中，GRK6是T、B淋巴细胞中C-X-C趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）活性的重要调节因子，磷酸化CXCR4能促进对β-arrestin的募集，从而介导CXCR4的泛素化降解，但它的缺失却使CXCR4的配体基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1/CXCL12）刺激所产生的淋巴细胞趋化作用受到了抑制，虽然具体的原因及作用机制尚不清楚，但是GRK6正调控淋巴细胞趋化作用的功能丧失可能是导致一些炎症相关疾病如类风湿性关节炎发生的关键原因[11]。在巨噬细胞中，GRK6能在磷酸化G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1（G proteincoupled receptor kinase interactor，GIT1）后激活Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1），促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬清除作用，而GRK6的缺失会导致凋亡细胞的累积造成小鼠自身免疫病的发生[12]。此外，GRK6还能磷酸化IκBα，促进TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活，增强炎症反应的发生[13]。

在神经系统中，GRK6能降低背根神经节中CXCR2的表达，对于减轻CXCR2信号通路介导的神经病理性疼痛的发生有着重要的作用[14]。同时，有研究发现GRK6能介导突触后D2样多巴胺受体的脱敏，抑制多巴胺受体的信号转导，表明GRK6具有调控多巴胺能反应的作用，有助于减轻左旋多巴治疗帕金森病时产生的副作用[15]。此外，GRK6还被报道能够通过磷酸化α-突触核蛋白促进帕金森病的发生，具有成为帕金森病治疗新靶点的潜力[16]。

3.1 GRK6与呼吸系统相关肿瘤

YAO等[17]研究发现，与正常肺组织相比，肺腺癌（Lung Adenocarcinoma，LADC）患者的肿瘤组织中GRK6的mRNA和蛋白表达水平都发生了明显下降，并且在晚期（Ⅲ～Ⅳ期）和低分化癌组织中表达量最低，表明GRK6的表达下调对肺腺癌的发生和发展有着重要的意义。此外，GRK6还是肺腺癌患者生存情况的一个独立预后因素，低表达患者的总生存率和生存时间都明显低于高表达患者[17]。进一步研究发现，在LADC组织中，GRK6基因的启动子区CpG岛发生了高度甲基化，导致与转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/Enhancer-Binding Protein-α，C/EBPα）的结合被抑制，从而造成了GRK6基因的表达下降[18]。GRK6的下调介导激活了上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）以及基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）的表达，增强了肺腺癌的迁移和侵袭能力[18]。其中EMT转化是肿瘤细胞发生迁移时的标志性事件，而MMPs则参与了细胞再生、程序性死亡、血管生成等生理过程，有助于加速EMT转化，它们都对肿瘤细胞的迁移具有促进作用。在GRK6敲低的肺腺癌细胞中，与EMT转化激活正相关的间充质细胞标志物波形蛋白表达上调，同时EMT负相关的上皮细胞标志物E-钙黏蛋白表达发生了下调，而过表达GRK6则会产生相反的效应，并且MMP-2和MMP-7的表达会被抑制，癌细胞的迁移和侵袭能力也明显下降[18]。在GRK6全身性敲除小鼠异位Lewis肺癌模型及肺癌转移模型中开展的研究发现，GRK6的缺失上调了CXCR2表达，导致CXCL8/CXCR2信号通路异常激活，MMP-2和MMP-9的表达量升高，促进了小鼠体内肿瘤的血管生成和生长增殖以及肺迁移的发生[19]。另有研究结果表明，GRK6的下调还能通过抑制林岛综合症相关抑癌基因（Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor，VHL）的表达，增加缺氧诱导因子（Hypoxia-Inducible Factor，HIF）的稳定性来激活肺腺癌细胞中的缺氧信号通路，从多方面对肺腺癌的发生发展进行调控[20]。

3.2 GRK6与消化系统相关肿瘤

免疫组化和免疫印迹实验分析发现，GRK6在肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）组织中的表达量明显高于癌旁组织，并且在分化程度低或转移能力强的肿瘤组织中表达量更高，说明GRK6可能与HCC的发生和转移有着密切的联系。生存曲线分析结果显示，GRK6高表达的患者生存率较低，因此GRK6的表达水平可作为HCC早期诊断以及预后情况分析的参考指标[21]。YIN等[22]研究发现，GRK6能磷酸化GPCR家族中的表皮生长因子受体亚家族成员分化簇抗原97（Cluster of Differentiation，CD97）发生脱敏作用，并通过与β-arrestin1结合使受体内化降解。在CD97高表达的肝癌组织中发现GRK6基因的启动子区存在高度甲基化，导致GRK6的表达下调而减少了CD97的脱敏内化。因此，在肝癌细胞中高表达的CD97能被配体CD55持续性地异常激活，并促进了下游与肿瘤迁移侵袭能力相关的基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达，同时由于GRK6的下调也具有促进MMP-2和MMP-9表达的作用，所以在这两种机制的协同作用下，HCC的转移和侵袭能力得到了显著增强。在这两项研究中发现的GRK6在肝癌组织中的表达变化虽然存在矛盾，但仍能提示GRK6的高表达或低表达可能会通过不同的分子机制促进肿瘤的发展，表现出了GRK6调控的复杂性，因此GRK6在肝癌中的功能还需进行进一步的深入研究。

有研究发现，在原发性结直肠癌患者的组织中，GRK6的表达量发生了明显的上调，其高表达与患者的一些临床病理指标的恶化如组织学分化、淋巴结转移、静脉浸润、浸润深度、远处转移以及TNM分期等存在显著的正相关性，并且GRK6高表达还会导致结直肠癌患者的生存率（5年）发生明显的下降[23]。研究结果表明，GRK6参与了结直肠癌的发生和发展，是一个较好的预测患者预后情况的生物标记物，同时也为揭示结直肠癌的发病机制提供了新的线索，还可能是一个潜在的治疗靶点。

3.3 GRK6与血液系统肿瘤

多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是血液系统的第二大常见恶性肿瘤[24]，由骨髓中的单克隆浆细胞发生癌变恶性增殖所导致，会使机体产生过量的单克隆免疫球蛋白[25]。新型靶向药物如免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂以及单克隆抗体药物的应用显著提高了多发性骨髓瘤的治疗效果，延长了患者的生存时间[26]。但由于未识别到有效的激酶靶点，激酶抑制剂在多发性骨髓瘤的治疗领域仍存在空缺。研究发现，GRK6在多发性骨髓瘤细胞系及患者组织中呈高表达[27]，抑制GRK6的表达能选择性地对多种骨髓瘤细胞系产生致死作用，而在其他细胞系中无影响或仅有微弱的影响，说明GRK6对多发性骨髓瘤细胞的存活发挥了关键性作用，并且具备成为体内耐受的药物作用有效靶点的潜力[28]。在多发性骨髓瘤细胞MM1R细胞中敲低GRK6后，凋亡抑制蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-Cell Leukemia/Lymphoma 2，BCL-2）的表达下降而促凋亡蛋白BCL-2相关X蛋白（BCL2-Associated X protein，BAX）的表达上升，具有促进细胞凋亡的作用，并且集中于晚期凋亡[27]。此外，GRK6的缺失还会导致信号传导和转录激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）磷酸化水平下降，下游促生存蛋白髓样细胞白血病蛋白-1（Myeloid Cell Leukemia 1，MCL-1）的表达量也降低，表明GRK6还能通过磷酸化激活STAT3信号通路促进多发性骨髓瘤细胞的存活[27-28]。目前已有针对治疗多发性骨髓瘤而研发的GRK6的小分子抑制剂，该抑制剂能够有效抑制GRK6的蛋白表达，并且对骨髓瘤细胞具有显著的杀伤作用，与其他抗骨髓瘤药物联合使用后还会产生更好的治疗效果[29]。

3.4 GRK6与神经系统相关肿瘤

有研究发现，在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中过表达GRK6后，M3毒蕈碱乙酰胆碱受体（M3 muscarinic Acetylcholine Receptor，M3 mAChR）的磷酸化水平发生了明显的增强并且导致受体同源脱敏[30]。M3 mAChR是典型的GPCR，在细胞内受神经递质乙酰胆碱的刺激而发生活化，能特异地与Gq类G蛋白结合，起始信号的传递。M3 mAChR广泛分布于人类的神经元细胞（中枢神经细胞和周围神经细胞）以及非神经元细胞中[31]，而在非神经元细胞中表达的乙酰胆碱和乙酰胆碱受体能够调控细胞增殖、迁移以及分化等重要功能，它的失调与多种癌症的发生发展相关[31-34]。GRK6对M3 mAChR的活性具有负调控作用，内源性和过表达的GRK6都能磷酸化M3 mAChR，促进它与Gαq/11解偶联，终止下游信号的传递[35-36]。虽然GRK6的表达变化对神经母细胞瘤的增殖生长或迁移是否产生了影响并未得到说明，但是鉴于M3 mAChR在其他癌症中的关键性调控作用，发现GRK6对它的磷酸化脱敏作用对于癌症发生机制的进一步理解具有重要的意义。

髓母细胞瘤（Medulloblastoma，MB）组织样本中发现了GRK6的表达下调，并且在转移性的肿瘤组织中表达量更少。分子机制研究表明，在MB中GRK6的表达和蛋白稳定性被血小板衍生生长因子受体（Platelet-Derived Growth Factor Receptor，PDGFR）及其下游效应蛋白Src所抑制，GRK6的下调促进了趋化因子受体CXCR4介导的信号通路激活，使下游效应蛋白细胞外调节蛋白激酶（Extracellular signal-Regulated Kinase，ERK）的磷酸化水平升高，导致了细胞迁移增加[37]。

GRK6在人胶质瘤中发挥了促癌作用[38]。肿瘤组织中GRK6的表达量明显高于正常脑组织，且病理分级越高的患者肿瘤组织内GRK6的表达量越高。在胶质瘤细胞中过表达和敲低GRK6后发现，GRK6通过调控细胞周期使细胞增殖能力显著提升。此外，还发现GRK6高表达有助于胶质瘤细胞对化疗药物替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）产生耐药性，降低药物对细胞的毒性以及诱导的细胞凋亡，表明在临床应用TMZ治疗胶质瘤时联合使用GRK6小分子抑制剂可能会产生更好的治疗效果。

越来越多的研究表明GRK6与肿瘤的发生和发展密切相关，涉及呼吸系统、消化系统、血液系统以及神经系统中的多种恶性肿瘤。但随着研究的深入，发现GRK6的调控机制非常复杂，在各类型肿瘤中的表达量变化也不尽相同，提示GRK6功能的多样性，且其可能会以组织或细胞依赖的方式发生改变。在肺腺癌和肝癌中的研究都发现GRK6的表达下调与基因启动子区发生了高甲基化相关，说明甲基化修饰可能是体内调节GRK6表达的一个重要手段，但是介导这一修饰作用的具体机制及相关的甲基转移酶尚未得到鉴别，未来在该方向上的进一步研究将有助于增加人们对GRK6在恶性肿瘤中作用的理解。尽管在各种恶性肿瘤中发生的改变有所不同，但GRK6促进肿瘤迁移和侵袭的效应几乎是共有的，表明GRK6在调控细胞迁移方面的重要性。目前GRK6在很多类型肿瘤中的作用及机制仍存在空缺，继续探究GRK6在其他类型肿瘤中发挥的作用对于系统地阐明GRK6的功能具有重要的意义，也将为各类肿瘤的治疗提供新的线索。