上海地区宠物犬源沙门菌的分离鉴定和耐药性分析

韩婧娥，李 晓，赵文鹏，高 健，秦顺义

(1.天津农学院动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 西青 300392 ；
2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193 ；

3.上海瑞鹏宠物医院有限公司，上海 崇明201914)

沙门菌(Salmonella)是无芽孢的革兰阴性杆菌，属于人兽共患病原菌，其感染能力较强，畜禽感染可引起仔猪霍乱、鸡白痢和犬肠胃炎等[1-3]，同时其也能引起人类食源性感染并引发食物中毒[4-5]，在世界范围内，每年都有人类因感染沙门菌而导致死亡的病例[6-7]。近年来，随着宠物犬数量的增加，由沙门菌感染引起宠物犬腹泻的病例也逐渐增加[3]；
使用抗菌药物是当前治疗犬沙门菌感染的主要手段，但由于抗菌药物的广泛应用，导致犬沙门菌耐药性问题日益严重。关于上海地区宠物犬沙门菌致腹泻的情况及其耐药性的研究较为罕见。本试验采集上海市部分宠物医院206份犬腹泻肛门拭子样品，进行沙门菌的分离、培养、鉴定和耐药性检测，以期为临床合理用药提供参考。

1.1 样品来源 2018年5月—2020年8月，在上海瑞鹏宠物医院有限公司下属的各宠物医院采集的腹泻宠物犬肛门拭子206份。质控菌株：沙门菌ATCC14028菌株，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 犬肛门拭子样品的采集 将采样棉拭子插入患犬肛门内，取样后将棉拭子插入采样管中封口，置于4oC保存用于后续沙门菌的分离。

1.2.2 病原菌的分离和纯化 将一次性接种环、沙门菌志贺菌琼脂培养基(Salmonella-Shigella agar,SS)平板、溶菌肉汤琼脂培养基(Luria-Bertani agar,LB)平板、麦康凯琼脂培养基(MacConkey agar,MAC)平板和大豆酪蛋白琼脂培养基(Tryptic soy agar,TSA)平板置于超净工作台，紫外照射15 min，用棉签蘸取适量的样品液，在平板上划线接种，将接种的平板置于37 ℃恒温培养箱中，倒置培养14 h。从培养箱取出平板并置于超净工作台内，用接种环挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，过夜振荡培养；
另挑取单菌落用四区划线法分别接种于SS平板、MAC平板和TSA平板，将平板置于37 ℃恒温培养箱，倒置过夜培养。

1.2.3 分离菌株的形态学观察 使用南京建成生物工程研究所提供的革兰染液对细菌进行染色，然后于显微镜下进行观察。

1.2.4 分离菌株的生化鉴定 筛选与沙门菌的菌落形态特征相符合且镜检结果为革兰阴性的菌株，接种于肠杆菌微量生化发酵管内进行生化鉴定，37 ℃培养14 h后参照生化鉴定管中肠杆菌科细菌生化鉴定说明书，对分离菌株的生化试验结果进行比对分析。

1.2.5 分离菌株的分子鉴定 (1)细菌基因组脱氧核糖核酸 (Deoxyribonucleic acid,DNA)提取及引物设计合成：将细菌过夜培养14 h，吸取1 mL菌液，12 000 r/min条件下离心3 min，弃上清液，常规提取细菌基因组DNA。设计合成16S核糖体脱氧核糖核酸(16S ribosomal deoxyribonucleic acid，16S rDNA)基因引物：上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，对分离菌株进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行测序分析。同时，设计合成沙门菌特异性基因invA引物[8]，上游引物：5′-AGTGCCGGTTTTATCGTGAC-3′；
下游引物：5′-CTCGCCTTTGCTGGTTTTAG-3′，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。(2)反应体系(20 μL)：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，无酶水7 μL，混匀之后，瞬时离心备用。(3)反应条件：94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32个循环；
72 ℃延伸10 min；
运行完后，将样品4 ℃保存备用。

1.2.6 分离菌株的药敏试验 采用微量肉汤法测定不同抗菌药对沙门菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。将灭菌后的96孔板中每孔加入100 μL水解酪蛋白肉汤(Mueller-hinton broth，MHB)培养基；
在96孔板中由上到下依次加入13种抗菌药100 μL，最后2排分别作为阴性和阳性对照，使用排枪将抗菌药进行2倍倍比稀释，把最后一孔的100 μL药液弃去；
在上述加过药液的96孔板中加入稀释好的菌液100 μL，从左至右依次加入。之后将96孔板置于恒温培养箱中培养24 h，观察有无细菌生长，以无细菌生长的最低稀释浓度作为检测抗菌药对沙门菌的MIC；
试验中能抑制50%和90%受试菌生长的浓度即为MIC50和MIC90。

2.1 分离菌株的形态学观察 部分分离菌株在含有脱纤维绵羊血TSA培养基上培养后，菌落形态呈现出圆形、表面湿润的特征(图1A)；
在LB营养琼脂培养基上培养后，菌落呈现出圆润、光滑的形态(图1B)；
在SS和MAC培养基上培养后生长为白色、透明、圆润的菌落(图1C、1D)，与沙门菌的菌落形态特征相符合。将与沙门菌的菌落形态特征相符合的菌株进行革兰染色，发现部分菌株经革兰染色呈现红色，菌体形态为单个或短链状排列的杆状或短棒状(图2)，属于革兰阴性杆菌。染色镜检后，在206份样品中共获得12株形态学特征与沙门菌相符的革兰阴性杆菌菌株，将这12株菌株继续进行后续试验。

图1 分离菌株培养特性Fig.1 Culture characteristics of isolated strainsA：分离菌株在TSA-绵羊血琼脂培养基上的形态特征；

B：分离菌株在LB琼脂培养基上的形态特征；

C：分离菌株在SS琼脂培养基上的形态特征；

D：分离菌株在MAC琼脂培养基上的形态特征A:Morphological characteristics of isolated strains on TSA sheep blood agar medium; B:Morphological characteristics of isolated strains on LB agar medium; C:Morphological characteristics of isolated strains on SS agar medium; D:Morphological characteristics of isolated strains on MAC agar medium

图2 分离菌株革兰染色镜检(100×)Fig.2 Gram staining microscopy of isolated strains (100×)

2.2 分离菌株的生化鉴定 分离菌株在葡萄糖、赖氨酸、硫化氢、卫茅醇和枸橼酸盐生化鉴定管中均呈阳性；
在鸟氨酸、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和尿素生化鉴定管中均呈阴性(表1)。将以上生化鉴定结果与肠杆菌科细菌生化鉴定说明书比对可知，该分离菌株生化鉴定结果符合沙门菌生化特征。

表1 分离菌株生化鉴定Table 1 Biochemical identification of isolated strains

2.3 分离菌株的分子鉴定 提取分离菌株DNA后，对16S rDNA基因进行PCR扩增，将分离菌株PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，分离菌株16S rDNA基因PCR产物电泳条带的大小一致，且与沙门菌标准菌株的基因组条带大小一致，约为750 bp(图3)。将PCR产物进行16S rDNA测序后经比对分析，确定所分离的菌株为沙门菌。

提取分离菌株DNA后，对沙门菌特异性基因invA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行电泳。结果显示，分离菌株特异性基因invAPCR产物电泳条带的大小一致，且与沙门菌标准菌株特异性基因invA基因大小一致，约为249 bp(图4)。

图4 分离菌株invA基因的PCR扩增Fig.4 PCR amplification of invA gene of isolated strains M：DL-2 000 DNA相对分子质量标准；

N：阴性对照；

1～12：各分离菌株invA基因片段；

13：阳性对照M:DL-2 000 DNA Marker; N:Negative control; 1-12:invA gene fragments of each isolated strain; 13:Positive control

2.4 分离菌株的药敏试验 对分离菌株的耐药性进行检测发现，检测药物MIC范围在0.06～128 μg/mL;分离的沙门菌菌株对不同的药物具有一定的耐药性，各种药物的MIC值分布为：头孢氨苄4～64 μg/mL，头孢曲松0.06～1 μg/mL，头孢噻呋0.25～2 μg/mL，头孢噻肟0.06～1 μg/mL，卡那霉素8～128 μg/mL，庆大霉素1～128 μg/mL，亚胺培南0.5～16 μg/mL，阿莫西林/克拉维酸16～128 μg/mL，恩诺沙星0.06～4 μg/mL，多黏菌素B 0.125～16 μg/mL，四环素4～128 μg/mL。

对分离菌株的MIC结果分析可知，分离的沙门菌菌株对阿莫西林/克拉维酸的耐药性最高，耐药率为100%；
其次是头孢氨苄，耐药率达到83.3%；
对四环素、庆大霉素和亚胺培南的耐药率分别为41.7%、41.7%和33.3%；
对卡那霉素、多黏菌素B和恩诺沙星的耐药率分别为16.7%、8.3%和8.3%；
对头孢曲松、头孢噻呋和头孢噻肟均敏感(表2)。

表2 分离菌株MIC检测Table 2 MIC detection of isolated strains

续表

腹泻是宠物犬的常见病和多发病，其致病因素较多，近年来，随着宠物行业诊疗水平的提升，由沙门菌感染引起的宠物犬腹泻的报道也逐渐增加[3,8-9]；
但上海地区沙门菌感染导致的宠物犬腹泻的病例和流行病学报道较少。本试验从采集的206份腹泻犬肛门拭子样品中分离得到12株疑似沙门菌，通过细菌形态学观察、生化鉴定和16S rDNA、沙门菌invA特异性基因PCR扩增鉴定，最终确定分离的疑似菌株为沙门菌。本试验结果显示，上海地区沙门菌感染导致宠物犬腹泻的比例为5.83%(12/206)，而其他地区沙门菌感染导致宠物犬腹泻的相关数据罕见报道；
仅有部分地区宠物犬沙门菌携带率的相关报道，如合肥市宠物犬沙门菌的携带率为2.55%(19/746)[10]，洛阳地区宠物犬沙门菌的携带率为17.5%(21/120)[11]，乌鲁木齐地区宠物(犬和猫)沙门菌的携带率则高达32.2% (99/307)[12]。依据上海地区沙门菌感染导致宠物犬腹泻的比例较低，推测上海地区犬沙门菌的携带率可能也处于较低水平。

目前，感染沙门菌后主要采用抗菌药进行治疗，然而抗菌药的广泛应用导致耐药沙门菌的数量迅速增加[8-9,13]。据报道，沙门菌对氟喹诺酮类和第3代头孢菌素等临床重要抗菌药物的耐药率正在逐年上升[14]。由于沙门菌在表型和遗传上的耐药性也各不相同，并受人和动物使用的抗菌药物种类的影响，造成沙门菌的耐药水平也不尽相同。因此，对犬沙门菌耐药性进行研究可为临床上治疗该菌引发的犬肠炎性腹泻提供重要参考。本试验通过对上海地区分离的宠物犬沙门菌的耐药性进行检测，发现上海地区宠物犬沙门菌的耐药问题比较严重。本试验分离的沙门菌对阿莫西林/克拉维酸完全耐药，对头孢氨苄的耐药率达到83.3%，对四环素、庆大霉素和亚胺培南的耐药率分别为41.7%、41.7%和33.3%，但是对第3代抗菌药头孢曲松、头孢噻呋和头孢噻肟均敏感。本试验结果与河南洛阳地区宠物犬沙门菌的耐药性研究结果[3]相比，两者对头孢氨苄、庆大霉素和恩诺沙星的耐药率相似，但对头孢曲松和头孢噻肟的耐药率相差较大。两者之间沙门菌耐药率的不同可能与所分离样本的地域有密切关系。本试验结果可为上海地区宠物犬感染沙门菌的临床治疗提供用药指导。