辛伐他汀联合岩藻多糖给药对大鼠BMSCs成骨分化的影响

王 莹 詹玉林，2

1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；

2.上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海 200233

骨骼是一种动态、复杂的生物组织。人体长骨所具有的再生能力源于骨骼在日常负荷下进行的不断重塑，当骨受到的损伤超过其自身愈合能力时便会造成临界骨缺损。以骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs）作为种子细胞来促进骨愈合是目前比较热门的方法。BMSCs是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，取材方便，免疫原性低，对不同原因造成的组织创伤具有一定的修复作用，治疗效果与细胞分化能力、细胞增殖和细胞迁移等生物学功能密切相关。自体间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在体内分化为功能性成骨细胞的能力相对有限，并且细胞离开人体后，其生物学功能也会受到影响。为了确保BMSCs在损伤部位能够更好地发挥功效，通常将其与药物、生物因子等联合用于骨缺损的治疗。

辛伐他汀（simvastatin， SIM）在临床上主要作为降脂类药物治疗心血管等疾病，除降低胆固醇外，还具有促进细胞分化、血管生成等功能。一些体外研究已证实，相比单独使用MSCs，与SIM联合使用可以明显增强后肢缺血小鼠的新生血管形成［1］。值得注意的是，SIM不仅可以促进细胞的增殖和分化，还可以在增强细胞和生长因子生物学功能的基础上，最大程度发挥协同治疗作用。血小板衍生生长因子与SIM联合递送后，牙槽组织生长的效果更好，且按一定顺序释放可以明显加速再生过程［2］。当基质细胞源性因子-1α与SIM联合作用于骨缺损部位时，不仅增加了生长因子的趋化能力，还增强了MSCs在体内的迁移和归巢，并促进新生骨组织的血管生成［3］。由此可见，应用SIM来增强BMSCs的成骨分化是刺激骨形成的一种有效策略，并且与其他生物分子的联合递送还可能加速组织再生过程，具有更加优越的成骨效果。

岩藻多糖（fucoidan， FD）是一类具有多种生物活性的海洋多糖，一般作为支架材料用于骨缺损和软骨损伤研究。FD可以促进人成骨细胞的增殖和COL Ⅰ的表达，在体外刺激成骨分化，在体内对骨矿化具有合成代谢作用［4-6］。FD对人体干细胞的增殖和分化已有一定研究，但关于FD对SD大鼠BMSCs的细胞毒性及其向成骨细胞分化的影响还未有文献提出。因此，本实验将FD与SIM共同作为诱导剂，从细胞水平和RNA水平上探讨两种药物联合后对BMSCs向成骨细胞分化的中期相关因子表达的影响，为骨缺损和关节软骨损伤修复提供新的研究思路。实验流程示意图如图1所示。

图1 实验流程示意图

1.1 实验动物

4周龄、体质量150 ~ 250 g的雌性和雄性SD大鼠各2只，由上海市第六人民医院中心实验室提供。设施许可证号为SCXK（沪）2017-0008。

1.2 实验试剂

DMEM基础培养基、胎牛血清，购自美国GIBCO公司；
青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶，购自苏州新赛美生物科技有限公司；
β-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸、地塞米松和二甲基亚砜，购自美国Sigma公司；
成脂肪诱导培养基、成软骨诱导培养基，购自广州赛业生物有限公司；
抗体CD29、CD44、CD45和CD90，购自美国Cell Signaling公司；
PBS、引物，购自上海生工生物股份有限公司；
CCK-8试剂、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 原代细胞的获取和鉴定

1.3.1 细胞提取和培养

将SD大鼠断颈处死后浸泡于体积分数为75 %的乙醇，并转移至超净工作台。用手术钳剔去骨表面的肌肉，剪去股骨和胫骨两端，暴露骨髓腔，用完全培养基反复冲洗骨髓腔，直至其发白。收集细胞悬液，室温离心1 000 r/min，10 min。弃上清液，调整细胞浓度为8 × 105/mL，均匀接种于细胞瓶，标为 P0代。在12 h后半换液，48 h后全量换液，拍照记录细胞形态和生长状况。当细胞汇合度大于80%，按1∶2传代，每2天换1次液，传至P3代待用。

1.3.2 细胞鉴定

1.3.2.1 形态学观察 观察原代细胞和传代细胞形态变化和生长状况，并拍照记录。

1.3.2.2 表型鉴定 将P3代细胞分为5管，调整密度为1 × 106/管，其中4管加入荧光标记的单克隆流式抗体，即抗大鼠CD29-FITC、CD90-FITC、CD45-PE和CD44-Alexa Fluor 647，空白管加入等量PBS，避光孵育30 min。孵育完毕，加入等量PBS，再次离心。离心结束，弃上清液，向每管加入400 μL PBS重悬细胞。流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。

1.3.2.3 成脂肪鉴定 P3代细胞按1 × 105个/孔的密度接种于六孔板，放入37 ℃、5% CO2恒温箱孵育。细胞贴壁后用成脂肪诱导培养基代替原培养基。每2 天半量换液。培养至第21天，进行油红O染色。

1.3.2.4 成软骨鉴定 将P3代细胞接种于15 mL离心管，密度为1 × 105/管，管盖稍稍拧开，放入37 ℃、5% CO2恒温箱中孵育。24 h后，观察细胞成团情况，用成软骨诱导培养基代替原培养基。每2天半量换液。培养至第21天，进行阿尔新蓝染色。

1.4 FD给药浓度的确定

1.4.1 实验分组 称取一定量FD粉末溶于PBS，用DMEM完全培养基将其梯度稀释至终浓度分别为 0.5、0.75、1、1.5、2、4 μg/mL。将上述鉴定为BMSCs的P3代细胞随机分为空白组和实验组（n=3），空白组为DMEM完全培养基，实验组为含有不同FD浓度的DMEM完全培养基。

1.4.2 细胞毒性检测 采用CCK-8法检测空白组和实验组培养1、2、3 d的细胞活性。每孔加入含10% CCK-8溶液的DMEM完全培养基，避光孵育2 h后使用酶标仪检测450 nm处的OD值。

1.4.3 qPCR 采用qPCR法检测空白组和实验组培养至第7天BMP-2和ALP mRNA的表达情况。培养至第7天，提取细胞中的总RNA。按试剂盒说明进行逆转录和qPCR。设计引物序列如表1所示。

表1 设计的引物序列

1.4.4 ALP定性和定量 ALP定性：培养至第7天，进行ALP染色，PBS清洗3次，加入适量多聚甲醛固定30 min。每孔加入2 mL显色液，室温避光孵育30 min，并拍照记录。ALP定量：培养至第7天，进行ALP定量分析。按照ALP检测试剂盒说明检测细胞中ALP的含量。

1.5 SIM联合FD给药的实验分组

SIM采用文献中认同的促进BMSCs成骨的适宜浓度1 × 10-7mol/L［7-8］。称取SIM 粉末溶于DMSO中，用成骨诱导培养基将其梯度稀释至终浓度为1× 10-7mol/L。根据前期实验配制FD溶液。将P3代BMSCs随机分为OM组、SIM组、FD组和SIM + FD组（n= 3）。OM组：成骨诱导培养基；
SIM组：含1 ×10-7mol/L SIM的成骨诱导培养基；
FD组：含适宜浓度FD的成骨诱导培养基；
SIM + FD组：含FD和SIM的成骨诱导培养基。

1.6 细胞毒性检测

采用CCK-8法检测OM组、SIM组、FD组和SIM +FD组培养1、2、3 d的细胞活性。每孔加入含10%CCK-8溶液的DMEM完全培养基，避光孵育2 h后使用酶标仪检测450 nm处的OD值。

1.7 细胞形态观察

OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组培养至第7天，拍照记录细胞形态。

1.8 qPCR

采用qPCR法检测OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组培养至第7天BMP-2、COLⅠ、RUNX2和ALP mRNA的表达情况。培养至第7天，提取细胞中的总RNA。按试剂盒说明进行逆转录和qPCR。设计引物序列如表1所示。

1.9 ALP定性和定量

ALP定性：培养至第7天，进行ALP染色，PBS清洗3次，加入适量多聚甲醛固定30 min。每孔加入2 mL显色液，室温避光孵育30 min，并拍照记录。ALP定量：培养至第7天，进行ALP定量分析。按照ALP检测试剂盒说明检测细胞中ALP的含量。

1.10 统计学分析

采用 GraphPad Prism 8和Image J统计软件进行实验数据处理，计量资料符合正态分布，采用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α = 0.05。

2.1 细胞鉴定

2.1.1 形态学观察 原代细胞形态观察：培养12 h，细胞分裂旺盛，由于瓶内存在红细胞等杂细胞而呈现红色的浑浊状态，通过2次换液去除当中的杂细胞和死细胞。铺板后2 ~ 3 d，细胞由圆形长为长梭形，触角伸出但尚未完全舒展开，形成了少量集落。培养3 d后，贴壁细胞数量明显增多，集落汇合度增加（图2A）。培养5 d后，可见大量单核、长梭形的贴壁细胞，成一定方向排列（图2B）。

图2 P0代BMSCs细胞形态（× 50）

传代细胞形态观察：细胞生长速度较快，细胞活性高，传代时间间隔缩短。细胞形态基本趋于一致，成纤维样贴壁生长（图3），表现出与BMSCs相似的形态学特征。

图3 P3代BMSCs细胞形态（A：× 50；
B：× 100）

2.1.2 流式鉴定 CD29、CD90和CD44为BMSCs表面特异性抗体，CD45为造血细胞的表面标记物。图4为P3代细胞表面特异性抗原的表达情况，从图中可以看出，细胞高表达CD29、CD90、CD44抗原，阳性率分别为99.1%、99.5%、99.4%，CD45低表达，为0.4%，符合BMSCs表型。

图4 P3代BMSCs表面抗原表达情况

2.1.3 成脂肪鉴定 在脂向分化过程中，细胞由长梭形逐渐变为圆形或者椭圆形，胞质内出现折光性高的脂滴，后期大小不一的脂滴汇聚成大脂滴，与油红O染料结合后呈橘红色或红色（图5），证明提取的细胞具有向脂肪细胞分化的能力。

图5 P3代BMSCs油红O染色（× 40）

2.1.4 成软骨鉴定 在向软骨细胞分化过程中，细胞由长梭形变为三角形或多边形，固定包埋常规切片后进行阿尔新兰染色（图6）。可以看到软骨细胞外基质中酸性黏蛋白和蛋白多糖被染成蓝色，细胞核染成了红色，证明提取的细胞具有向软骨细胞分化的能力。

图6 P3代BMSCs阿尔新蓝染色（× 40）

2.2 FD给药浓度的确定

2.2.1 细胞毒性检测 采用CCK-8法检测含有不同浓度的FD对BMSCs增殖的影响，结果见图7。与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜ 0.001），BMSCs的活性随着培养时间和FD的浓度增加而增加，表明FD可以刺激细胞生长。

图7 培养1、2、3 d时空白组和实验组的细胞活性（A：第1天；
B：第2天；
C：第3天）

2.2.2 qPCR 图8为空白组和实验组培养至第7天BMP-2、ALP mRNA的表达情况。结果显示，浓度为1 μg/mL的FD组，两种基因的mRNA表达量均高于空白组和其他实验组，提示浓度为1 μg/mL的FD对BMSCs的增殖和成骨分化可能较为有利。在此基础上，进行ALP定性和定量分析，进一步确定FD的给药浓度。

图8 空白组和实验组培养至第7天BMP-2、ALP mRNA的表达情况（A：BMP-2；
B：ALP）

2.2.3 ALP定性和定量 图9为空白组和实验组培养至第7 天的ALP染色结果。图中可见，随着FD浓度的升高，颜色由浅变深再变浅，其中浓度为1 μg/mL的FD组染色最深。定量结果同样显示浓度为1 μg/mL的FD组活性最高（图10）。综合所有实验结果，选择浓度为1 μg/mL的FD，与SIM共同诱导BMSCs在体外成骨诱导环境下的成骨分化。

图9 空白组和实验组培养至第7天的ALP染色结果（× 50）

图10 空白组和实验组培养至第7天的ALP的定量结果

2.3 SIM联合FD给药对BMSCs的毒性作用

采用CCK-8法检测OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组培养1、2、3 d的细胞活性，实验结果见表2。SIM+FD组的细胞活性在培养1、2、3 d内均高于OM组、SIM组和FD组，差异具有统计学意义（P＜ 0.001），表明两种药物联合后可以提高细胞活性。

表2 OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组BMSCs细胞培养1、2、3天的细胞活性（，n=3）

表2 OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组BMSCs细胞培养1、2、3天的细胞活性（，n=3）

注：
BMSCs：骨髓间充质干细胞；

OM：成骨诱导培养基；

SIM：辛伐他汀；

FD：岩藻多糖。三个时间段内，SIM+FD组与OM组比较，a P ＜ 0.05；
与SIM组比较， bP ＜ 0.05；
与FD组比较， cP ＜ 0.05

培养时间3 d 1.416 ± 0.054 1.745 ± 0.046 a 1.932 ± 0.055 ab 2.072 ± 0.027 abc 110.200＜ 0.001组别OM SIM FD SIM+FD F P 1 d 0.6397 ± 0.018 0.722 ± 0.016 a 0.74 ± 0.022 a 0.8207 ± 0.022 abc 44.010＜ 0.001 2 d 0.9497 ± 0.035 1.453 ± 0.042 a 1.535 ± 0.040 a 1.649 ± 0.038abc 189.100＜ 0.001

2.4 细胞形态观察

图11为各组培养至第7天BMSCs的细胞形态和生长状况。从图中可以看出，SIM+FD组细胞数量明显多于OM组和单一加药组，表明两种药物联合后对细胞的增殖具有促进作用，与细胞毒性检测结果一致。

图11 OM组、SIM组、FD组和SIM + FD组培养至第7天BMSCs的形态（× 50）

2.5 qPCR

表3为OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组培养至第7天BMP-2、COLⅠ、RUNX2以及ALP mRNA的表达情况。从表中可以看出，SIM+FD组4种基因的mRNA表达量均高于SIM组和FD组（P＜0.001），提示SIM和FD的联合给药可以促进BMSCs成骨相关因子的表达，并有利于BMSCs向成骨细胞分化。

表3 OM组、SIM组、FD组和SIM + FD组BMSCs细胞培养至第7天的qPCR结果（用2-△△Ct表示， ，n = 3）

表3 OM组、SIM组、FD组和SIM + FD组BMSCs细胞培养至第7天的qPCR结果（用2-△△Ct表示， ，n = 3）

注：与OM组相比， a P ＜ 0.05；
与SIM组相比， b P ＜ 0.05；

与FD组相比， c P ＜ 0.05

ALP 1 1.667 ± 0.031 a 1.816 ± 0.020 ab 1.977 ± 0.014 abc 1407.000＜ 0.001组别OM SIM FD SIM+FD F P BMP-2 1 1.353 ± 0.008 a 1.385 ± 0.012 ab 1.463 ± 0.010 abc 1643.000＜ 0.001 COLⅠ1 1.682 ± 0.014 a 1.775 ± 0.011 ab 2.051 ± 0.016 abc 3946.000＜ 0.001 RUNX2 1 1.829 ± 0.014 a 1.874 ± 0.012 ab 2.135 ± 0.009 abc 6947.000＜ 0.001

2.6 ALP定性和定量

图12和13为OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组培养至第7天的ALP染色情况，总体上呈现由浅到深的趋势，其中SIM + FD组颜色最深，说明此组细胞分泌的ALP最多。表4为各组ALP的定量结果，可以发现，SIM + FD组ALP的活性明显高于OM组、SIM组和FD组，差异具有统计学意义（P＜0.001），与ALP定性结果一致。

图12 OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组培养至第7天的ALP染色结果（A：
× 50；
B × 100）

图13 OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组培养至第7 天的ALP染色结果

表4 OM组、SIM组、FD组和SIM+FD组BMSCs细胞培养至第7天的ALP定量结果（n = 3）

骨髓来源的MSCs具有良好的增殖能力和迁移能力，在生长因子的调控下可以跨胚层向多种谱系分化，在治疗临床组织缺陷性疾病中具有巨大的应用价值［9］。BMSCs可以通过自体获得，免疫排斥反应低，不涉及伦理和道德问题，相比胚胎间充质干细胞、脂肪间充质干细胞具有更加显著的优越性。本实验根据BMSCs贴壁生长而骨髓中其他细胞不贴壁的特性，从SD大鼠股骨和胫骨的骨髓腔中提取到原代细胞，体外扩增培养后进行细胞形态学观察、细胞表面标志物检测以及成脂肪和成软骨鉴定，实验结果证明获取的细胞符合BMSCs的表型，可用于后续成骨诱导培养。

FD是一种存在于褐藻和海藻细胞壁中的天然多糖，具有广泛的生物活性，如促进细胞成骨分化、细胞增殖以及抑制炎症等［10-11］。近年来，关于FD促进细胞增殖和分化的实验研究日益增多，并显示出可观的研究成果。Lu等［12］发现京尼平交联的羟基磷灰石-羟丙基壳聚糖水凝胶经FD吸附后，不仅增加了7F2成骨细胞中ALP的活性，并进一步改善了骨形成。当壳聚糖-藻酸盐支架中加入FD，其蛋白吸附能力和矿化能力是未加FD支架的2倍［13］。将磷酸三钙-壳聚糖-岩藻聚糖生物复合支架浸泡于模拟体液中7天后，结果显示，FD的加入促进了复合材料表面磷灰石层的形成［14］。但是这些研究大部分都集中于FD复合支架的制备和性能研究上，而将FD直接作用于干细胞的实验，涉及到的主要是人脂肪干细胞、牙周膜干细胞以及人间充质干细胞，有关FD对SD大鼠BMSCs增殖和分化的影响还不清楚。本实验通过细胞毒性检测、qPCR以及ALP定性和定量分析实验发现，1 μg/mL的FD可能比较适宜BMSCs的生长和分化。

SIM为羟基-3-甲基戊二酰辅酶A （HMGCoA） 还原酶抑制剂，是脂溶性他汀类药物，较水溶性他汀类药物具有更好的成骨作用，通过介导对调节成骨细胞功能至关重要的生长因子的表达来促进成骨细胞分化和矿化，如BMP-2、血管内皮生长因子［15］。Cui等［16］将有无SIM的聚乳酸支架植入大鼠临界大小颅骨缺损模型和兔的临界大小颅骨缺损中，2周后，SIM组兔外周血中自体内皮祖细胞数量显著高于对照组，并从中获得了经实验证明与BMSCs形态特征和生物学特性相符的细胞，大鼠缺损区在SIM组植入2周后也检测到了强烈的GFP信号，这种信号是利用GFP转染的BMSCs作为示踪细胞注射进大鼠体内。提示SIM不仅参与内皮祖细胞向血管损伤部位募集和迁移的过程，还可以将具有良好生物学特性的BMSCs招募到缺损处，促进局部血管生成和颅骨缺损愈合。SIM在分子和细胞水平上对调节骨再生过程具有多效作用，并且与其他生物分子的联合递送明显优于单一生物分子传递的骨再生效果。因此，根据其生物学效应，联合多种生物分子可能是促进骨愈合的最佳策略。

基于以上研究成果，本实验将SIM和FD共同作为诱导剂，探讨在体外成骨诱导环境下，两种药物联合后对BMSCs向成骨细胞分化的中期的影响。研究发现，在培养的第1天、第2天和第3天，与OM组、SIM组和FD组相比，SIM+FD组细胞活性最高，差异具有统计学意义（P＜ 0.001）。第7天，SIM +FD组细胞数量明显多于其他3组，说明两种药物联合后可以促进BMSCs的增殖。RUNX2是参与调节MSCs成骨分化的主要转录因子，能够激活与启动MSCs向成骨细胞系分化并调节成骨细胞的成熟，对于COLⅠ等成骨细胞标记基因的表达也至关重要［17-18］。在第7天，检测了成骨相关基因的表达情况，发现SIM + FD组4种基因的表达量明显高于OM组和其他实验组（P＜ 0.001），表明两种药物联合后可以促进BMSCs成骨相关因子的表达，并有利于BMSCs的骨向分化。ALP是成骨细胞的早期表型标志物，其活性随着成骨细胞成熟而增加，分泌的高峰期在BMSCs成骨分化过程中的7到14天［19-20］。ALP定性和定量结果显示，SIM + FD组染色最深，ALP活性最高，与qPCR结果一致。综上所述，在体外成骨诱导环境下，SIM联合FD可使得BMSCs向成骨细胞分化过程中细胞活性升高、相关因子表达量增加。

骨骼疾病是影响全球数百万人健康和长寿的重要因素，除了带来身体上的痛苦，还有经济层面的压力。干细胞治疗似乎是目前修复受损组织、恢复骨骼功能的一种有前途的方法。BMSCs是使用最广泛的细胞类型，通过细胞归巢、细胞分化以及炎症反应在内的多种机制帮助骨组织的修复和再生。一些天然和合成化合物已经被证明对BMSCs的成骨分化有积极的影响。本研究发现，SIM与FD的联合给药可以明显促进BMSCs向成骨细胞分化，提高培养7 d后成骨相关因子的表达量，较单一给药显示出较大的优势。SIM作为临床上使用较多的降胆固醇药物，临床副作用常表现为肝功能异常、转氨酶升高以及肌肉损伤。在体外实验中，除了研究两种药物对BMSCs活性的影响，往往还会忽略是否对肝细胞和肌肉细胞造成影响。与此同时，伴随关节损伤和骨缺损修复产生的炎症反应也是治疗过程中较为棘手的问题，尽量避免持续使用抗生素类药物而产生耐药菌的同时，对治疗骨损伤的药物也提出了更高的要求。有研究指出，SIM可以通过减少白介素6等促炎因子的释放来减少炎症反应［8］。而FD通过调节Akt/GSK3β/PTEN/NFATc1信号通路和钙调磷酸酶活性来阻止脂多糖诱导的炎症性骨丢失［21］。SIM和FD不仅可以促进骨形成，还具有抗炎、促进血管生成、抑制破骨细胞活性等功能，为进一步的临床应用提供了一定的理论基础。但是，对于实际的临床病例来说，缺损部位、缺损体积以及局部微环境等相比构建的动物模型和体外环境都复杂的多，修复过程往往是发生在多因素的条件下。

综上所述，为了更好地应用于临床，SIM联合FD对BMSCs成骨分化的实验研究以下几方面还有待补充。（1）体外实验：检测两种药物联合后对肝脏细胞、肌肉细胞等正常细胞的影响。确定SIM联合FD给药的抗炎效果。（2）体内实验除了需要观察骨缺损的愈合效果，还有炎症反应、血管生成情况等。基于以往的实验研究，除了修复骨缺损和关节软骨缺损外，推测SIM和FD对于骨关节炎、骨质疏松等退行性疾病可能也存在一定的治疗潜力。由此可见，相比其他药物，SIM和FD具有更加出色的临床应用前景，同时也期待能够早日应用到临床上。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突