超高压耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶特性和水分迁移的影响

邹怡茜，陈海强,2，潘卓官，肖苏尧，周爱梅*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.阳江职业技术学院食品与环境工程系，广东阳江 529500）

超高压技术是一种非热加工新技术，应用领域涉及肉制品、乳制品、水产品、果蔬产品等[1]。超高压不破坏分子共价键[2]，可显著改善物料的结构特性[3]，改善食品的品质[4,5]。大量研究表明，超高压诱导水产品凝胶化有望作为热处理诱导凝胶化的替代方案[6-9]，但单独的超高压处理一般需要较高压力（海水鱼300～600 MPa，淡水鱼400～600 MPa）水平才能得到较好品质的鱼糜凝胶制品[2,10-13]，例如，前人研究发现带鱼[28]、金线鱼[35]、鲢鱼[38]、鳙鱼[2]鱼糜单独超高压处理的最优处理压力分别为300～350 MPa/5 min、400 MPa/15 min、400 MPa/15 min、500 MPa/30 min，这导致超高压设备投入和生产运行成本过高，不利于超高压技术在鱼糜制品加工中的产业化应用。我们前期研究表明，中超高压耦合热处理在改善低值海水鱼鱼糜凝胶特性方面显著优于单纯较高压力的超高压处理和传统的二段加热处理[13]，但该技术对淡水鱼鱼糜凝胶特性的影响还需进一步研究。

随着传统优质海水鱼鱼糜原料产量的下降以及我国鱼糜制品需求量的不断攀升，海水鱼已无法满足鱼糜产业的发展需求，价格低廉、产量稳定的淡水鱼有望成为鱼糜制品加工的新原料。但相比于海水鱼，淡水鱼普遍存在凝胶形成能力弱的问题，采用传统的二段热处理技术无法满足生产高品质鱼糜制品的需求，因此急需采用新技术来提高淡水鱼鱼糜制品的凝胶特性。鳙鱼，又称花鲢、胖头鱼、大头鱼、黑鲢、黄鲢[14]，是我国主要的淡水鱼之一。2020 年我国鳙鱼养殖产量高达3.13×106t，占全国淡水鱼养殖产量的10.13%[15]。鳙鱼富含蛋白质、矿物质，氨基酸组成均衡性好，且脂肪酸组成具有较高的营养价值[16]。研究发现，鳙鱼较其他淡水鱼所制成的鱼糜的凝胶特性适中[17-19]，适合作为淡水鱼鱼糜制品的生产原料代表。此外，由于鱼糜凝胶是肌原纤维蛋白相互交联形成的网络结构，通过截留水分形成的弹性凝胶体，而经过不同加工处理的鱼糜凝胶，其水分子的存在状态和分布会发生改变，进而导致水分迁移，因此水分迁移与鱼糜凝胶网络的结构密切相关，并影响鱼糜的凝胶特性[20]。

本文以淡水鱼的代表鳙鱼冷冻鱼糜作为研究对象，开展不同压力（100～500 MPa）耦合热处理（40 ℃/30 min，90 ℃/20 min）对鳙鱼鱼糜凝胶的凝胶强度、持水性、白度及质构的影响，并探究超高压耦合热处理对鱼糜凝胶水分含量和分布的影响，以期为淡水鱼加工生产优质的鱼糜制品提供有益参考。

1.1 试验材料

新鲜鳙鱼，购于广州市长湴菜市场；
食盐，广州盐业公司提供；
蔗糖、山梨糖醇，食品级。

1.2 仪器与设备

UHPF-600 MPa 超高压设备，中国包头科发高压科技有限责任公司；
DS-1 高速组织捣碎机，上海标本模型厂；
DM-JRJJ 灌肠器，中国德明；
CT3 质构仪，美国Brookfield；
CR-10 色差仪，日本日立；
HH-S8 水浴锅，金坛市医疗仪器厂；
EVO MA 15 扫描电子显微镜，德国ZEISS；
低场核磁共振仪，苏州纽迈分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

鱼糜的制备：新鲜鳙鱼去鳞、去头、去内脏、采肉、绞肉、漂洗（用5 倍冰水漂洗2 次/10 min，0.15%NaCl 漂洗1 次/10 min）、脱水、加抗冻剂（m=4%蔗糖、m=4%山梨糖醇）。

鱼肠的制备：参照周爱梅等[21]的方法并略修改。冷冻鳙鱼鱼糜在4 ℃冰箱中解冻8 h 后，切成2 cm 的方块并采用高速组织捣碎机将其捣碎1 min，根据冷冻鱼糜的质量加冰水，将鱼糜水分含量调至79%左右，再添加2.5%（m/m）的食盐，继续捣碎4 min，赶气后用灌肠器将鱼糜灌入至肠衣中，鱼肠长度在15 cm 左右。将鱼肠分别在100、200、300、400、500 MPa 压力下常温保压15 min，然后采用二段加热法（40 ℃/30 min后再采用90 ℃/20 min 加热）处理，记为超高压耦合热处理组（PH）；
单纯采用二段加热法处理为对照组（0.1 PH）。所有加热后的鱼糜凝胶样品立即置于冰水中冷却（1 h），在4 ℃冰箱放置24 h 后进行分析测定。

1.3.2 鱼糜凝胶凝胶强度的测定

选用CT-3 质构仪测定鱼糜凝胶的破断力（g）、凹陷深度（mm），二者乘积为凝胶强度（g·cm）。具体测定方法为，将鱼肠平衡至室温后（2 h），切成直径20 mm、高25 mm的柱形体进行测定。选用直径为5 mm的P/5 探头，测试速度为1.0 mm/s，返回速度为1.0 mm/s，触发力为4.0 g，循环次数为1 次，每个样品做5 个平行样。

1.3.3 鱼糜凝胶质构的测定

参考 Maqsood 等[22]的方法对样品的硬度（Hardness ）、弹性（Springiness ）、内聚性（Cohesiveness）、咀嚼性（Chewiness）和胶着性（Gumminess）进行测定。质构分析参数设定为：预测试速度为2 mm/s，测试速度为1.5 mm/s，测试后探头上升速度为1.5 mm/s，形变量为50%，触发力为25 g，循环次数为2 次。每组鱼糜凝胶样品重复测量7 次。

1.3.4 鱼糜凝胶持水性（WHC）的测定

参考Pan 等[23]的方法测定持水性能。把鱼糜凝胶样品切成小块（0.5 cm×0.5 cm×2 cm），用两层滤纸包裹后置于50 mL 离心管内，在10 000×g下4 ℃离心10 min，持水性计算公式为：

式中：

H——鱼糜凝胶持水性（WHC），%；

CG——鱼糜凝胶离心前的质量，g；

CG’——鱼糜凝胶离心后的质量，g。

1.3.5 鱼糜凝胶白度的测定

参考Balange 等[24]的方法测定鱼糜凝胶的色差。将鱼糜凝胶样品切成厚3 mm 的圆片，采用色差仪CR-10进行样品色度分析。测定鱼糜凝胶的L*（亮度）、a*（红度）、b*（黄度），白度（D）计算公式为:

1.3.6 鱼糜凝胶十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

参考Chen 等[13]的方法测定鱼糜凝胶的SDS-PAGE。

1.3.7 鱼糜凝胶微观结构的观察

参考Chen 等[25]的方法，将鱼糜凝胶切成3 mm×3 mm×3 mm 的薄片，在室温下，用2.5%（V/V）戊二醛固定12 h 后，在0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 值7.0）中浸泡10 min，依次用不同梯度（30%、50%、70%、80%、90%和100%）的乙醇溶液脱水10 min，冷冻干燥，喷金，扫描电子显微镜放大10 000 倍对样品进行观察。

1.3.8 鱼糜凝胶水分迁移的分析

将处理后的鱼糜凝胶切成直径20 mm、高30 mm的柱形体置于核磁管中，采用磁场强度为0.5 T 的低场核磁共振（LF-NMR）分析仪分析鱼糜凝胶的水迁移率和分布，具体参考Wang 等[26]的方法进行测量分析。

1.3.9 数据处理方法

使用Origin-pro 9.1 软件进行绘制，数据采用SPSS 19.0 软件进行显著性、方差和相关性分析。

2.1 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶强度的影响

凝胶强度是指凝胶崩裂或断裂时单位面积所受的力，反应凝胶内部结构的坚实程度[27]。由图1a 和1b可知，超高压耦合热处理鱼糜凝胶的破断力和凹陷深度随着压力的增大呈先增加后减小的趋势，两者均在300 MPa 时达到最大值，与传统二段加热的对照组（0.1 PH）相比，分别增加了60.23%和17.38%（p＜0.05）。图1c 表明，超高压耦合热处理的鳙鱼鱼糜凝胶的凝胶强度显著高于0.1 PH（p＜0.05）样品，其中100、200、300、400、500PH 样品的凝胶强度分别比0.1 PH 样品（232.65 g·cm）提高了33.19%、38.08%、88.40%、50.05%、32.19%，过高压力（＞300 MPa）处理下，鱼糜凝胶强度显著降低（p＜0.05）。这与Chen 等[28]研究结果相似，当压力达到400 MPa 或以上时，高压与热处理耦合的鱼糜凝胶强度显著降低。Ye 等[29]也得到类似结果，鲢鱼鱼糜凝胶经超高压结合热处理，凝胶强度在压力为300 MPa 时最大。我们前期研究结果发现，鳙鱼鱼糜单独超高压处理的最优处理压力为500 MPa[2]，而压力耦合热处理的最优压力为300 MPa，表明超高压耦合热处理可显著降低压力的需求，这有利于超高压技术在鱼糜产业中的推广应用。

图1 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶强度的影响Fig.1 Effect of different pressure coupled heat treatment on the gel strength of bighead carp surimi

二段热处理是鱼糜制品加工企业广泛应用的鱼糜凝胶化方法[30]。在二段加热的40 ℃热处理阶段，鱼糜内源性转谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）催化鱼糜蛋白质的谷氨酰胺残基和赖氨酸残基进行交联，促进蛋白质-蛋白质的结合[31]，形成品质较好的鱼糜凝胶。本研究发现，超高压耦合热处理（40 ℃/30 min，90 ℃/20 min）对鳙鱼鱼糜凝胶强度的改善显著高于传统的二段热处理（p＜0.05），这可能是由于超高压促进鱼糜蛋白质的展开，使其二级结构中的β-折叠结构增多，活性巯基基团暴露。这些有利于在后续的热处理阶段中内源性TGase 催化蛋白质-蛋白质交联，形成致密的网络结构，最终表现出更好的凝胶特性[12,32]。相对于更高压力耦合热处理组，300 MPa 超高压耦合热处理在改善鱼糜凝胶强度方面更具有优势，这可能是因为鱼糜内源性TGase 活性随着压力的增加而降低[33]，过高压力（＞300 MPa）抑制内源性TGase 活性，从而不利于蛋白质-蛋白质的交联。此外，蛋白质展开和聚集的相对速度在鱼糜凝胶网络的形成中起着关键作用，在过高压力（＞300 MPa）处理下，鱼糜凝胶蛋白聚集速率比展开速率快，不利于蛋白质-蛋白质之间的交联，导致蛋白质快速形成大聚体并破坏均匀的凝胶结构，从而导致鱼糜凝胶的凝胶强度下降[13,34]。

2.2 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶持水性的影响

持水性体现了鱼糜凝胶的保水性，持水性越高，说明鱼糜凝胶内部的水分越不易流失。由图2 可知，鳙鱼鱼糜凝胶持水性的变化和凝胶强度的变化较一致，超高压耦合热处理的鳙鱼鱼糜凝胶具有更高的持水能力，其中300PH 样品的持水性为76.92%，较传统二段热处理的对照组样品的持水性（73.43%）显著提高了4.75%（p＜0.05）。然而，随着压力进一步增加，鳙鱼鱼糜凝胶的持水性呈下降趋势，其中500PH 鱼糜凝胶的持水性相对于300PH 样品和对照组的持水性分别下降了10.37%和6.12%，这可能是由于过高压力不利于鱼糜凝胶网络结构的改善，导致鱼糜凝胶持水性下降[13]。适当的压力耦合热处理促进鱼糜蛋白质之间的交联，形成更加致密和均匀、更有弹性、更具包埋水分子能力的层次化三维网络结构，从而能锁住更多水分，使鱼糜凝胶具有更高的持水性[35,36]。

图2 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶持水性的影响Fig.2 Effect of different pressure coupled heat treatment on the water holding capacity of bighead carp surimi gel

2.3 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶白度的影响

白度是鱼糜凝胶的色泽指标，是评价鱼糜制品品质的指标之一[28]。如图3 所示，不同压力耦合热处理的鳙鱼鱼糜凝胶均获得较高的白度值（82.25～84.01），白度整体相差不大。中等水平压力（100～300 MPa）耦合热处理所获得的鳙鱼鱼糜凝胶的白度值与对照组较接近（p＞0.05），随着压力的继续升高，白度值呈上升的趋势（p＜0.05），500PH 样品的白度值获得最大值（84.01），这与前人[37,38]的研究结果相似，加热可导致鱼糜凝胶白度的增加[32]。鳙鱼属红肉鱼，经过压力耦合热处理后，鱼糜凝胶白度的增加可能归因于肌红蛋白在热处理过程中的变性，类似烹饪过程中肉色的变化[39]。此外，超高压处理使鱼糜凝胶网络形成更小的孔洞，增加其不透明度，减少光吸收，从而提高白度[9]。

图3 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶白度的影响Fig.3 Effect of different pressure coupled heat treatment on the whiteness of bighead carp surimi gel

2.4 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶质构的影响

由表1 可见，在不同的压力耦合热处理下，300PH鱼糜凝胶的硬度、胶着性、咀嚼性显著高于其他处理组（p＜0.05）。虽然300PH 鱼糜凝胶的弹性与其他压力耦合热处理组无显著差异（p＞0.05），但仍显著高于传统二段热处理的对照组。300PH 鱼糜凝胶的内聚性显著高于500PH 鱼糜凝胶的内聚性，但与对照组和其他压力处理组无显著差异（p＞0.05）。300PH 样品的硬度、内聚性、弹性、胶着性、咀嚼性较对照组依次增加了32.11%、2.72%、4.52%、34.83%、41.02%，表明适当压力耦合热处理可以显著地改善鳙鱼鱼糜的质构特性，这与前人的研究结果相似[25,38]。这可能是由于超高压处理改变鱼糜蛋白质的构象，促进鱼糜蛋白质-蛋白质和蛋白质-水的相互作用，而后续的加热处理进一步增强了鱼糜凝胶网络中蛋白质的连接性和刚性，最后形成结构完整、排列紧密有序的凝胶网络结构，从而呈现出更高的硬度、内聚性、胶着性和咀嚼性[32]；
但过高的压力（＞500 MPa）会使鱼糜蛋白凝胶变性和聚集，致使凝胶网络排列不规则，凝胶结构变差[40]。

表1 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶质构的影响Table 1 Effect of different pressure coupled heat treatment on the texture of bighead carp surimi gel

2.5 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶SDS-PAGE 的影响

肌原纤维蛋白在对肉制品的内聚结构和质地起重要作用，主要的蛋白质是肌球蛋白重链（MHC）、肌动蛋白（Actin）[28]。由图4 可知，随着压力的增加，MHC条带和Actin 条带的强度逐渐增强，压力处理超过300 MPa 可能使肌原纤维结合丝氨酸蛋白酶钝化，导致MHC 降解降低[13,28]。相对于0.1PH，300PH样品的Actin条带密度显著性增加。100PH～300PH 样品比400PH 和500PH 样品的MHC 条带密度弱，说明适度的压力处理耦合热处理促使肌球蛋白重链交联或降解[5]。此外，在热处理期间，TGase 催化MHC 的交联[36]，适度的压力处理可以诱导蛋白质的展开，使肌球蛋白更容易被TGase 催化交联[41]。

图4 不同压力耦合热处理条件下鳙鱼鱼糜凝胶的SDS-PAGE图像Fig.4 SDS-PAGE image of bighead carp surimi gel under different pressure coupled heat treatment

2.6 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶微观结构的影响

凝胶质构的物理性质与微观结构密切相关，致密有序的网络结构可能具有更高的持水性和凝胶强 度[13]。从图5 可以看出，不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶微观结构具有明显改善作用。传统二段热处理的对照组样品表面不平整，鱼糜凝胶蛋白交联形成粗大的团簇状聚集体，结构松散分布不均匀。300PH 鱼糜凝胶的空间结构较平整光滑、有序均匀、结构致密、孔洞数量明显减少。适当的超高压处理可使鱼糜蛋白质通过不同程度的展开和变性而改变结构，从而促进蛋白质凝胶的改变，有助于后续热处理获得连续均匀的凝胶[42]，而过高压力处理，会导致鱼糜蛋白质的降解或解聚，蛋白质不规则聚集，堆积成块，不利于水分保持在鱼糜凝胶网络结构中，导致鱼糜凝胶强度和质构特性降低[43]。

图5 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶微观结构的影响Fig.5 Effect of different pressure coupled heat treatment on the microstructure of bighead carp surimi gel

2.7 不同压力耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶水分迁移的影响

采用低场核磁共振成像技术分析不同处理条件所获得的鳙鱼鱼糜凝胶的水分分布情况、弛豫时间和峰面积。弛豫时间（T2）反映鱼糜蛋白质和水分子的结合情况，其中T21代表与大分子鱼糜蛋白紧密结合的结合水，T22反映被滞留在鱼糜凝胶结构中的水，为不易流动水，而T23对应于鱼糜凝胶结构外的流动性较大的自由水[44]。如图6 和表2 所示，100PH、200PH、300PH鱼糜凝胶样品的T21和T22无显著性差异（p＞0.05），并且没有表现出与凝胶强度变化类似的趋势，表明这两部分的结合水能力对凝胶强度的提高贡献较小。而随着压力的增加，PH 组鱼糜凝胶的T21呈下降的趋势，这可能是由于超高压耦合热处理能形成更均匀致密的凝胶网络结构，增强对结合水的束缚，减弱水的流动性，从而导致水分子的弛豫时间降低[45]。A21、A22、A23分别为结合水、不易流动水和自由水的单位质量峰面积，表示不同状态水分的相对含量[46]。由图6 或表2可以看出，超高压耦合热处理鱼糜凝胶样品均检出自由水的峰，且0.1PH（对照组）样品A23（自由水单位质量峰面积）显著高于压力耦合热处理组样品（p＜0.05）。0.1PH 样品的A22显著小于其他压力耦合热处理组的A22，其中300PH 样品的A22最高，这与凝胶强度和持水性一致，超高压耦合热处理增强鱼糜蛋白与水分的紧密结合，使自由水向不易流动水迁移。此外，300PH鱼糜凝胶的A21显著高于0.1PH 的A21，表明超高压耦合热处理促进水与蛋白质的结合，更有利于增加鱼糜凝胶结合水的含量，这可能是由于超高压耦合热处理更有利于形成更致密的鱼糜凝胶网络结构，增加结合水的含量，减弱凝胶中水分子的流动性[47]。

表2 不同压力耦合热处理条件下鳙鱼鱼糜凝胶水分迁移率和水分分布的影响Table 2 Effect of different pressure coupling heat treatment on water mobility and water distribution of bighead carp surimi gel

图6 不同压力耦合热处理条件下鳙鱼鱼糜凝胶T2弛豫时间的分布Fig.6 Distribution of T2 relaxation time of bighead carp surimi gel under different pressure coupled heat treatment conditions

磁共振成像（MRI）可以描述鱼糜的内部结构状态和质子的分布。伪彩图颜色的深浅反映水分的含量，高质子密度对应红色，水分含量较高；
反之，颜色越暗（偏蓝），水分含量少[48]。由图7 可知，超高压耦合热处理组的鳙鱼鱼糜凝胶较对照组颜色偏红、黄，说明压力耦合热处理有利于鱼糜凝胶锁住水分子。上述结果说明，超高压耦合热处理有利于增加鱼糜凝胶对结合水和不易流动水的束缚，降低凝胶中水的流动性，从而导致鱼糜凝胶呈现更高的持水性。

图7 不同压力耦合热处理条件下鳙鱼鱼糜凝胶的MRI 图像Fig.7 MRI image of bighead carp surimi gel under different pressure coupled heat treatment

2.8 相关性分析

由不同压力耦合热处理下不同指标之间的聚类热图（图8）分析可知，在不同压力耦合热处理条件下，鳙鱼鱼糜凝胶的凝胶强度与质构特性、A21、A22以及白度聚为一大类，表明这些指标间的相关性可能比较高。由表3 可知，鱼糜凝胶的破断强度、凹陷深度、硬度、内聚性、弹性、胶着性、咀嚼性、A21、A22、A23与凝胶强度的相关系数分别为0.99、0.91、0.97、0.68、0.94、0.98、0.98、0.74、0.83、-0.76。由此可知，在不同压力耦合热处理条件下，超高压耦合热处理改善鱼糜凝胶的凝胶强度与凝胶的破断强度、凹陷深度、硬度、弹性、胶着性、咀嚼性、A22具有高度正相关性（相关系数＞0.8），与凝胶的内聚性、A21具有中度正相关性（相关系数在0.5～0.8 之间），与A23呈负相关。综上所述，超高压耦合热处理改善鳙鱼鱼糜凝胶的凝胶强度是由鱼糜凝胶特性中的破断强度、凹陷深度、凝胶质构特性的提高所贡献，鱼糜凝胶中的水分分布的状态和含量的变化与鱼糜的凝胶强度、凝胶网络结构密切相关，300PH 诱导鱼糜凝胶形成致密多孔有序的凝胶网络，使自由水向不易流动水和结合水迁移，并增强对水分的束缚能力，凝胶网络结构与水分的变化共同影响鱼糜凝胶的特性。

图8 压力耦合热处理鳙鱼凝胶特性与各指标之间的聚类热图Fig.8 The clustering heat map between the gel characteristics and various indicators of bighead carp surimi gel under different pressure-coupled heat treatment

表3 不同压力耦合热处理形成的鱼糜凝胶强度和其他指标的相关性分析Table 3 Correlation analysis of surimi gel strength and other indicators formed by different pressure coupled heat treatment

超高压耦合热处理对鳙鱼鱼糜凝胶特性的改善显著高于传统的二段热处理（p＜0.05）。随着压力的提高，鳙鱼鱼糜的凝胶强度、白度和质构特性得到显著改善。核磁共振弛豫时间和相应的峰面积表明，适当的超高压耦合热处理形成的鱼糜凝胶结构对结合水的束缚能力显著高于传统的二段热处理样品（p＜0.05），A23（自由水单位峰面积）显著降低，有利于鱼糜凝胶水分的保持，提高持水性。过高压力耦合热处理不利于鱼糜凝胶蛋白与水的相互作用，500PH 鱼糜凝胶样品的凝胶强度、持水性、质构特性显著下降（p＜0.05）。因此超高压耦合热处理会影响鱼糜凝胶内的水分分布，能显著改善鱼糜的凝胶特性，提高鱼糜凝胶的品质。SDS-P AGE 表明，超高压耦合热处理可导致肌原纤维蛋白中MHC 和Actin 的降解。根据相关性分析，超高压耦合热处理下的鳙鱼鱼糜凝胶的破断强度、硬度、弹性、咀嚼性、A22与凝胶强度显著性相关（相关系数＞0.8），与A21呈中度相关性（相关系数在0.5～0.8 之间），说明鱼糜的凝胶强度、质构特性与水分状态共同影响鱼糜的凝胶特性，300PH 有利于鳙鱼鱼糜凝胶形成致密网络结构，锁住更多的结合水，并限制不易流动水向自由水迁移，从而改善鱼糜凝胶的凝胶特性。