组蛋白精氨酸甲基化酶在人体外受精发育阻滞胚胎中的功能研究

黄雪梅，樊 军，马蓉宁，江酉琼，冷 媚，叶 飞

(四川省妇幼保健院生殖医学中心，成都 610045)

体外受精和胚胎移植技术用于治疗不孕症已有多年1]。随着最佳排卵诱导和有效胚胎培养系统的发展，试管婴儿的妊娠率有所提高，但试管婴儿治疗的效率仍然很低[2]。目前，每个胚胎移植周期的临床妊娠率仅为30%～40%，胚胎植入率仅为20%～30%[3]。受精后第3天，只有30%～50%的胚胎可以形成囊胚。大多数胚胎被阻滞8个细胞到桑葚胚阶段。10%～15%的体外受精胚胎表现出永久性的细胞周期阻滞状态，40%的体外受精每个周期至少显示1个阻塞的胚胎，这导致患者妊娠率较低[4]。目前研究早期胚胎发育基本发生机制的较少。

组蛋白精氨酸甲基化酶(PRMT)在早期胚胎发育中有重要作用，PRMT7的过度表达会破坏早期胚胎发育过程，导致早期胚胎发育停滞，但发育停滞的缺陷可以通过敲低PRMT7蛋白来部分挽救[5]。组蛋白精氨酸甲基化酶6(PRMT6)是一种核酶，主要催化组蛋白H3在精氨酸2(H3R2me2a)上的不对称二甲基化，PRMT6与许多基本的细胞过程有关，包括细胞周期的调节、核受体介导的转录及干细胞多能性的维持[6]。有研究[7]显示，抑制PRMT6可导致多能基因的下调和分化标记物表达的诱导，提示PRMT6与胚干(ES)细胞多能性和自我更新相关。本文旨在研究PRMT6在人体外受精发育阻滞胚胎中的作用。

1.1 阻滞胚胎的收集与分析

收集2019年1月到2021年12月四川省妇幼保健院丢弃的70枚体外受精人类胚胎，其中12枚正常发育的胚胎(第3天培养的多精受精的胚胎细胞数>5)为正常组，12枚发育阻滞胚胎(第3天培养的多精受精的胚胎细胞数≤5)为阻滞组，46枚发育阻滞胚胎进行PRMT6敲除(PRMT6敲除组)。使用连续单一培养基进行培养。本实验得到本院伦理委员会的批准。

1.2 PRMT6的敲除

使用Eurofin MWG Operon siRNA设计软件设计针对PRMT6的siRNA序列，并将其克隆到pSUPER.puro载体中以表达短发夹RNA(shRNA)，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染后，分别用嘌呤霉素(1 μg·mL-1)选择细胞3 d，后在细胞里包装浓缩成pLVX-IRES-ZsGreen1-hPRMT6慢病毒。显微镜下往每枚阻滞胚胎注射慢病毒(滴度108 TU·mL-1)3～5 nL，注射后的胚胎使用连续单一培养基进行培养,观察胚胎7 d的发育情况，最后进行RNA提取和蛋白质提取。

1.3 RNA提取、cDNA合成和定量实时聚合酶链反应(qPCR)

参照说明书，使用MicroElute Total RNA试剂盒提取总RNA(Omega Bio-Tek)。根据说明使用TRIzol试剂(美国Invitrogen)从胚胎中提取RNA，分光光度法验证RNA质量，A260/A280比值在1.8和2.0之间，从2 μg DNase处理的总RNA样品中用寡核苷酸(dT)引物和PrimeScriptTM逆转录酶(TaKaRa)合成cDNA。cDNA稀释10倍，用于qRCR。使用SYBR预混料EX Taq试剂盒(中国大连Takara)在定量实时聚合酶链反应检测系统(BIO-RAD)上按制造商的建议进行荧光qPCR实验。

1.4 免疫荧光

PRMT6分布使用以下一抗的免疫荧光来确定：用DAPI(Beyotime Biotechnology)染色细胞核，荧光偶联二抗染色胞质，用40×1.25油物镜的共聚焦显微镜收集共聚焦图像。

1.5 蛋白质印迹

使用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液(Solarbio)提取总蛋白，并且通过加入10 μL蛋白的裂解缓冲液。在冰上裂解30 min后，样品以12 000 g离心20 min。电泳2 h后转移至膜上。将膜用脱脂奶粉封闭1 h，并与一抗过夜。后将膜与二抗(1/2000；
Abcam，美国)一起孵育1 h。ECL(Absin,Shanghai,China)显色、暗室曝光、显影后，通过凝胶成像系统获得蛋白质条带。

1.6 统计学方法

2.1 PRMT6在发育阻滞胚胎中上调

免疫染色及蛋白印迹检测结果表明，与正常组相比，阻滞组的PRMT6蛋白质水平显著增加[(1.160±0.054)比(1.530±0.13)]，H3R2me2升高[(1.340±0.019)比(1.710±0.011)]，H3K4me3水平下降[(1.650±0.030)比(1.220±0.015)],差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。提示PRMT6水平的升高与胚胎分化相关。

*P<0.05与正常组比较。图1 正常组和阻滞组PRMT6蛋白质、H3R2me2和H3K4me3水平(免疫染色和蛋白印迹检测)

2.2 敲除PRMT6降低发育阻滞胚胎的分化标记基因表达

qPCR和蛋白印迹检测结果显示，与阻滞组比较,PRMT6敲除组PRMT6 RNA[(1.660±0.029)比(1.230±0.017)]、PRMT6蛋白[(1.400±0.030)比(1.050±0.058)]及H3R2me2蛋白[(1.410±0.011)比(1.340±0.019)]水平显着下调，而H3K4me3[(1.710±0.011)比(1.340±0.019)]水平升高；
多能性标记Oct4[(1.710±0.016)比(1.160±0.049)]、Nanog[(1.690±0.089)比(1.260±0.051)]和Sox2[(1.680±0.091)比(1.310±0.057)]的水平被下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

#:从PRMT6敲除组中随机选出12枚敲除胚胎。*P<0.05，与阻滞组比较。图2 阻滞组和PRMT6敲除组PRMT6及分化标记基因的表达(蛋白印迹检测)

2.3 阻滞组和PRMT6q敲除组的胚胎发育情况

培养阻滞组和PRMT6q敲除组胚胎7 d，阻滞组没有发育，PRMT6敲除组可以挽救部分发育停滞的胚胎，甚至单个发育受阻的胚胎也可以发育成融合胚胎数，有18枚阻滞胚胎发育成为4～7细胞，22枚阻滞胚胎发育成为8～12细胞，5枚阻滞胚胎发育成为囊胚，1枚阻滞胚胎发育成为融合胚胎。阻滞组和PRMT6q敲除组的胚胎发育情况比较差异有统计学意义(P<0.05)。可见，PRMT6水平的下调会驱动阻滞胚胎分化成内胚层谱系和其他的细胞类型。

早期胚胎发育阻滞是人类生育治疗效率低下和反复治疗失败的主要原因。早期胚胎发育在胚胎发育过程中起着突出的作用[8]。本研究中，与正常发育胚胎相比，发育阻滞胚胎中的PRMT6升高。提示发育阻滞缺陷可以通过PRMT6蛋白的降低来部分挽救。

近年来，组蛋白精氨酸修饰已成为多能性的新调节剂，组蛋白精氨酸甲基化酶4(PRMT4)先前曾被报道在维持细胞多能性方面起重要作用[9]。ES细胞中CARM1的缺失导致Oct4和Sox2的下调，最终引导ES细胞分化成各种谱系[10]。最近的PRMT5敲除研究表明，组蛋白精氨酸甲基化酶5(PRMT5)对于早期内细胞质量形成至关重要[11]。这些结果都强调了PRMT在早期胚胎的重要性。研究发现PRMT6具有甲基化自身的能力，它是PRMT家族的I型酶，催化不对称精氨酸二甲基化[12]。PRMT6是负责H3R2甲基化的主要甲基转移酶，PRMT6通过介导H3R2甲基化在拮抗H3K4残基的甲基化中起作用[13]。鉴于H3K4甲基化一直与多能分化基因(包括Nanog和Oct4)相关，本研究分析了H3R2me2与发育阻滞胚胎的发育作用。结果发现在发育阻滞胚胎中PRMT6升高。此外，发育阻滞胚胎组H3R2me2升高，而H3K4me3水平下降，这表明PRMT6水平的升高与胚胎分化相关。

有研究[14]发现,Oct4、Sox2和Nanog组成的复杂转录调控网络对于维持细胞分化十分重要，包括组蛋白修饰和染色质重塑在内的表观遗传修饰在调节细胞多能性中起重要作用。H3K4me3的富集在核心转录因子Oct4、Sox2和Nanog的启动子中，并通过招募核小体重塑酶作为基因激活标记，而H3K4me3可促进染色质结构来抑制基因表达[15]，PRMT6介导的H3R2me2拮抗H3K4甲基化，可调节基因表达。本研究结果发现，PRMT6的下调使H3K4me3水平升高，导致H3R2me2降低，发现多能性标记Oct4、Nanog和Sox2的水平被下调。这表明PRMT6有助于维持阻滞胚胎的未分化状态。

IVF的人类胚胎容易发育停滞，这大大降低了IVF治疗的效率[5]。正如预期的一样，本研究观察阻滞组和PRMT6敲除组胚胎发育情况至第7天时，PRMT6敲除组有18枚阻滞胚胎发育成为4～7细胞，22枚阻滞胚胎发育成为8～12细胞，5枚阻滞胚胎发育成为囊胚，1枚阻滞胚胎发育成为融合胚胎，而阻滞组未见胚胎发育。这表明敲除PRMT6可以挽救部分发育停滞的胚胎。该研究的局限性:首先，本研究为单中心、小样本研究，其结论需要在多中心、大样本研究中得到证实；
其次，阻滞胚胎是来自不同患者的胚胎,没有分析患者胚胎间的不同。

总之，与对照胚胎相比，阻滞胚胎中的PRMT6蛋白质水平显著增加，敲除PRMT6后，阻滞胚胎中H4R3me2s的甲基化水平也显著升高。击倒PRMT6可以挽救部分发育阻滞的胚胎，甚至单个阻滞胚胎的胚胎也可以发育成融合胚胎。故PRMT6的敲除会促进阻滞胚胎发育。