高效液相色谱法检测肺炎克雷伯氏菌发酵液中的3-羟基丙酸

田 甜，张 炎，平文祥，葛菁萍, b, *

(黑龙江大学 a．生命科学学院微生物省高校重点实验室，哈尔滨 150080; b．农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500)

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)碳骨架的两端分别为一个羧基和一个羟基，化学性质非常活泼，其成品为无色、无味的油状液体[1]。3-HP通过氧化、还原、脱水、酯化反应等可合成多种重要的化学物质，还可作为食品或饲料的添加剂和防腐剂，是一种应用价值极高的有机化合物[2-4]。3-HP的合成分为化学合成法和生物合成法，相对于化学合成法来说，生物合成法可避免化学合成法所带来的弊端，更具有发展潜力[5]。微生物生产3-HP的途径主要以葡萄糖、甘油和CO2为底物。其中，以甘油为底物的生产方式因其具有简单的代谢途径、底物廉价及无环境污染等优点[6]，是最利于工业化生产的途径。

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌，生长速度快，在有氧和厌氧条件下均可以甘油作为唯一的碳源生长[7-8]。由于K.pneumoniae自身存在着完整的维生素B12合成体系，可在厌氧条件下合成维生素B12，天然产生的维生素是用于合成商业上重要的化学品3-HP的必需辅助因子[9-11]。因此，近年来对K.pneumoniae生产3-HP的研究逐渐增多[12]。K.pneumoniae利用甘油生产3-HP的过程中，常伴有乳酸等副产物的产生，然而3-HP与乳酸为同分异构体，性质相近。在利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测3-HP产量时，常会遇到两者色谱峰重叠、难以有效检测3-HP 产量的问题[13]。通过选择与优化HPLC的检测条件来有效分离3-HP和乳酸混合标样是非常重要的。Su M Y等[14]利用HPLC对K.pneumoniaeDSM 2026发酵液中的3-HP进行分离与检测，准确度高、检测效果好。但关于选择与优化HPLC的检测条件来有效分离3-HP和乳酸的文献鲜有报道。

本文通过选择与优化HPLC的检测条件，建立了一种简单、快速、准确度高的检测方法，不仅提高了3-HP的检测效率和检测精度，还可以准确检测发酵过程中产物的变化。

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

K.pneumoniaeHD67，由黑龙江大学微生物省重点实验室保藏。

1.1.2 供试培养基

LB培养基(g·L-1)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH调整为7.0，121 ℃灭菌15 min。

发酵培养基(g·L-1)：甘油20，酵母粉3，磷酸二氢钾1.3，磷酸氢二钾3.4，硫酸铵4，硫酸镁0.5，碳酸钙0.1，微量元素1.25 mL，pH值调至7.0，121 ℃灭菌15 min。

1.1.3 仪器与设备

高效液相色谱仪LC20A(日本岛津)；
美国伯乐HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm, 5 μm)；
依特利C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)。

1.2 试验方法

本试验选择HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm, 5 μm)和C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，探究色谱柱类型对3-HP的保留时间及其分离效果的影响。选择5 mmol·L-1H2SO4和5 mmol·L-1H3PO4，探究流动相种类对3-HP的保留时间及其及分离效果的影响。在流动相中常加的2种有机相：乙腈和甲醇，分别配制成1%、5%和10%的相应溶液，探究有机相的添加对3-HP的保留时间及其分离效果的影响。选择4种流速：0.4 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1，探究不同流动相流速对3-HP的保留时间及其分离效果的影响。选择5种柱温：35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃和75 ℃，探究色谱柱柱温对3-HP的保留时间及其分离效果的影响。在最优HPLC条件下，对同一发酵液连续进样5次检测，计算相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)。在最优HPLC条件下，对同一浓度发酵液分别在0、2、4、6、8 h进样1次检测，对其RSD值进行计算。

2.1 色谱柱对检测条件的影响

通过HPX-87H色谱柱和C18色谱柱对3-HP的保留时间及其分离效果的比较研究，结果见表1。虽然HPX-87H色谱柱和C18色谱柱均可分离检测3-HP和乳酸混合标样，但是HPX-87H色谱柱的分离度超过2.0，而且在实验过程中稳定性较高。因此，色谱柱型号选择为HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm, 5 μm)。

2.2 流动相的选择

2.2.1 流动相对检测条件的影响

通过对5 mmol·L-1H2SO4和5 mmol·L-1H3PO4两种流动相对3-HP的保留时间及其分离效果的比较研究，结果见表2。混标的分离度在流动相为5 mmol·L-1H2SO4时达到最好为2.367。因此，选择流动相为H2SO4。

表1 不同色谱柱下3-HP的保留时间及分离效果

表2 不同流动相下3-HP的保留时间及分离效果

2.2.2 有机相对检测条件的影响

通过对添加不同种类有机相对3-HP的保留时间及其分离效果的比较研究，结果见表3。添加5%和10%的乙腈以及1%的甲醇时检测不到混合标样的色谱峰，而1%的乙腈的分离效果很差。随着甲醇浓度的上升，混标的分离度先上升(1.763)后降低(1.025)。然而分离度最好的条件下较不添加有机相时的分离度差(表2，2.367)。因此，选择不添加有机相。

2.3 流速和柱温的选择

2.3.1 流速对检测条件的影响

表3 不同有机相下3-HP的保留时间及分离效果

一般情况下，在相同的温度，随着流速越低，混标的分离效果越好，但色谱柱的柱压也越来越低，其测样时间也会变长。通过不同流速对3-HP的保留时间及其分离效果的比较研究，结果见表4。流速为1.0 mL·min-1时，测样时间为12 min且最短，混标的分离度较好，但是色谱柱的柱压较高，且在实际检测过程中，柱压在短时间内迅速升高，流速为0.8 mL·min-1时也具有同样的问题；
流速为0.4 mL·min-1时，低流速引起分析时间过长。综上，流速选择0.6 mL·min-1。

表4 不同流速下3-HP的保留时间及分离效果

2.3.2 柱温对检测条件的影响

通过不同柱温对3-HP的保留时间及其分离效果的比较研究，结果见表5。柱温越高，混标分离度越高，但温度超过75 ℃时，检测不到标样混合物的峰，造成这种现象的原因可能是：3-HP受热易分解，在较高的温度下，分子结构受到破坏。因此，本试验选择柱温65 ℃。

2.4 回归分析、检出限测定

根据3-HP标准曲线y=50 842x+61 665，相关系数r=0.999 8，说明线性关系良好。且以3倍

表5 不同柱温下3-HP的保留时间及分离效果

信噪比(S/N)计算检出限为5 μg·mL-1，表明检测具有较高的灵敏度。

2.5 方法性能评价

2.5.1 精密度试验结果

HPLC检测3-HP的精密度试验结果见表6。由表6可见，对3-HP的色谱峰面积进行计算，RSD结果为0.618%，表明此HPLC具有良好的精密度。

2.5.2 稳定性试验结果

HPLC检测3-HP的稳定性试验结果见表7。由表7可见，根据3-HP的色谱峰面积计算RSD为0.773%，发酵液在8 h内均具有良好的稳定性，此分析方法可靠。

表6 HPLC检测3-HP的精密度试验结果

综上所述，检测3-HP的保留时间及分离效果的最佳色谱条件见表8。另外，获得了3-HP的标准曲线：y=50 842x+61 665，r=0.999 8，说明此检测条件具有选择性和重现性好、准确度和灵敏度较高等优点，适用于对接下来单因素优化实验的发酵过程及其代谢产物的检测。

HPLC检测成功的基础是选择一个合适的色谱柱，C18色谱柱固定相的极性小于流动相的极性，3-HP和乳酸标准品极性大于流动相极性，不宜使用此色谱柱[15]。当选择HPX-87H色谱柱时，3-HP和乳酸标混合标准品分离度高，且峰形完好。Jiang J Q等[9]采用HPLC，配备HPX-87H色谱柱测定K.pneumoniaeJJQ02发酵液中3-HP的产量。流动相对改善3-HP和乳酸的分离效果也有重要的辅助效应，流动相是影响HPLC性能的重要因素，正确的选择流动相至关重要[16]。Chen Y等[17]采用HPLC，以0.5 mmol·L-1H2SO4为流动相测定酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)代谢产物3-HP的产量。

表7 HPLC检测3-HP的稳定性试验结果

表8 检测3-HP含量的最佳色谱条件

此外，流速的大小直接关系到色谱柱柱压及分析时间的变换。流速过低，则柱效差且分析时间长；
流速过高，则柱压高且分析时间短。因此，选择适当的流速利于保护色谱柱。詹元龙[18]利用HPLC，在0.6 mL·min-1的流速下，检测分析大肠杆菌(Escherichiacoli)发酵液中3-HP产量。柱温也是影响色谱柱柱效和混标分离度的主要因素之一。随着柱温的升高，降低流动相粘度，使有机酸在流动相中发生解离平衡，能够有效提高柱效;有机酸在离子状态下不利于色谱柱对其分离，而且高温会对色谱柱的内部造成一定的损耗。Kumar V等[19]采用HPLC，在柱温为65 ℃时，测定K.pneumoniaeJ2B代谢产物3-HP的产量。

HPLC法测定K.pneumoniae中3-HP产量的方法有所差异，差异主要表现在流动相种类及其浓度、柱温的不同，可能是所用仪器类型及型号和色谱柱的不同，在实验中也发现，同样的仪器、色谱柱及相同的条件，不同型号仪器的检出效果差异很大。

K.pneumoniaeHD67中3-HP产量的最佳HPLC检测条件为：色谱柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm, 5 μm)；
流动相5 mmol·L-1H2SO4，不加有机相；
流动相流速0.6 mL·min-1；
柱温65 ℃；
进样体积20 μL；
检测器为紫外检测器(210 nm)。本研究建立HPLC检测K.pneumoniaeHD67中3-HP产量的方法具有操作简便、准确度和灵敏度较高等优点，为后续单因素优化实验发酵过程及其代谢产物的检测提供了可供借鉴的技术支持。