高效液相色谱法测定熟党参中5-羟甲基糠醛的含量

吕立铭，高 娟，李大炜，申 茹，毛一中

(惠州卫生职业技术学院，广东 惠州 516025)

党参来源于桔梗科植物党参[Codonopsis pilosμla(Franch.)Nannf.]、素花党参[Codonopsis pilosμla Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen]或川党参[Codonopsis tangshen Oliv.]的干燥根，其性味甘平，具有健脾益肺、养血生津功效，临床上常用于治疗脾肺气虚、食少倦怠、咳嗽虚喘、气血不足、面色萎黄、心悸气短、津伤口渴、内热消渴证[1]。党参主要成分为聚炔类[2-3]、生物碱类[4-5]、糖类[6-7]、萜类[8-9]、木质素类[10-12]、黄酮类[13-14]等，其炮制方法主要有米炒[1]、麸炒[15]、蜜炙[16]、土炒[17]等，此外，还有部分地方采用清蒸方法来炮制[18-19]。党参经过清蒸加工成熟党参后，口感变甜，颜色变黑，原因推测为5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量增加。据研究报道，5-HMF具有多种药理活性，譬如抗氧化活性[20-21]、改善血液流变学[22-23]、抗心肌缺血作用[24-25]、降血糖作用[26-27]、抗肿瘤细胞增殖活性[25，28]等，但含量超过一定限度，就会对人体产生危害。过量的5-HMF会损害人体横纹肌、内脏、基因和神经等，对眼睛、皮肤、上呼吸道及黏膜有刺激作用[29-32]。然而，关于熟党参中5-HMF的含量测定研究尚未见报道。笔者通过高效液相色谱法，创建了熟党参中5-羟甲基糠醛(5-HMF)的含量测定方法，希望能为今后党参的炮制研究和质量控制提供思路和方法。

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司，美国)，Capcell pak C18色谱柱(资生堂公司，日本，型号4.6 mm×250 mm，5 μm)；
旋转蒸发仪RE-3000A(上海越众仪器设备有限公司，中国)，电子天平FA2004N(上海菁海仪器有限公司，中国)，超声清洗机PS-40A(深圳市科洁超声科技有限公司，中国)，BPG-9204A电热式鼓风干燥箱(上海百典仪器设备有限公司，中国)；
立式万用电炉(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，中国)；
HH-8数显恒温水浴锅(江苏金坛市环宇科学仪器厂，中国)。

试药：党参(产地：山西晋城市陵川县六泉乡庙怀村)药材经惠州卫生职业技术学院中药教研室祁银德教授鉴定，为桔梗科植物党参[Codonopsis pilosμla(Franch.)Nannf.]的干燥根，符合2020年版《中国药典》一部规定)，5-HMF对照品(GC≥98%，批号：20170519，上海金穗生物科技有限公司，中国)，乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，中国)，甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司，中国)，超纯水。

2.1 色谱条件

色谱柱：Shiseido Capcell pak C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：V乙腈∶V水=(5：95)，检测波长：280 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：常温(25 ℃)。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

准确称取5-HMF对照品2.8 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀.配成浓度为0.028 mg/mL对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

准确称取党参饮片500 g，置于蒸制容器内，隔水蒸2 h至有香甜味时取出，干燥，得到熟党参样品[18]。准确称取熟党参样品粉末(过二号筛)0.50 g，置于100 mL锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，超声30 min，再静置，称定重量，用甲醇补足减失的重量，而后摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取中间部分续滤液作为供试品溶液，备用[33-34]。

2.3 线性关系考察

准确吸取对照品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别进样0.5 μl、1μl、2μl、4μl、8μl、10 μl。以对照品溶液进样量(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y=5323.8x-6.6486，(R2=0.9999)。结果表明，5-HMF进样量在0.014 μg～0.28 μg范围内线性关系良好(见表1，图1、2)。

表1 5-HMF线性关系考察表

图1 5-HMF对照品高效液相色谱图

2.4 精密度试验

准确吸取对照品溶液10 μl，按“2.1”项色谱条件，连续进样测定6次，分别测定5-HMF峰面积积分值，计算相对标准偏差，对照品溶液峰面积积分值的平均值为1487.13，RSD值为0.58%(n=6)。结果表明仪器精密度良好(见表2)。

图2 5-HMF标准曲线图

表2 5-HMF精密度试验结果表

2.5 重复性试验

准确称取同一批次熟党参粉末(过二号筛)0.50 g，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份，按“2.1”项色谱条件，分别准确吸取10 μl进样测定，测得样品中5-HMF的平均含量为 4.89 mg/g，RSD值为1.76%(n=6)。结果表明该方法重现性良好(见表3)。

表3 5-HMF重复性试验结果表

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在制备后0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h，各进样10 μl，测得5-HMF峰面积积分值的平均值为 256.58，RSD值为1.12%(n=6)。结果表明供试品溶液在制备后24 h内具有良好的稳定性(见表4)。

表4 5-HMF稳定性试验结果表

2.7 加样回收率试验

按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备9份供试品溶液，分别加入一定量的5-HMF对照品，按“2.1”项色谱条件，进样10 μL，测定5-HMF峰面积积分值，按外标法计算样品中5-HMF的含量，得到平均加样回收率为98.91%，RSD值为1.22%，结果表明该方法准确可靠(见表5)。

表 5 5-HMF加样回收率试验结果表

2.8 样品含量测定

取收集到的不同批次熟党参样品6份，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项色谱条件，分别进样10 μl，计算5-HMF峰面积积分值，以峰面积积分值按外标法计算样品中5-HMF的含量(见表6、图3)。

表6 不同批次熟党参中5-HMF的含量(n=3)

图3 熟党参高效液相色谱图

关于5-HMF安全性评价经历了相当长的时间，其危害也逐渐被发现。5-HMF具有多种药理活性，只有在较高的浓度下才显示弱毒性，在特定条件下，也可以引起人体某些指标发生一定的变化，但并没有造成严重危害。也就是说，在常规的摄入量范围内，5-HMF并不存在严重的安全风险[31-32]。

根据文献研究发现，5-HMF的主要来源有两条途径，一是由氨基酸和还原糖发生美拉德反应生成，二是在酸性环境中，由糖的受热分解产生，且含量随着时间的积累和温度的升高而增加[34-36]。对于富含糖类成分的中药，在炮制加工和储存等过程中，都会不可避免地发生美拉德反应和糖的热降解反应(还原糖的分解及蔗糖的焦化)而产生5-HMF[36]。中药炮制加工是一个复杂的成分变化过程，2020年版《中国药典》对于米炒党参炮制品的质量要求只要求了性状检查，党参炔苷薄层色谱定性检查，水分、总灰分、二氧化硫限量检查和浸出物含量检查，缺乏具体的药效成分来进行定量鉴别。鉴于党参成分复杂，势必造成党参炮制品质量难于控制[36]。

党参是中医传统的补益类中药，也是我国常用的药食同源食材，其在炮制和贮存的过程中，5-HMF含量会随着温度的升高和时间的积累而增加。特别是在蒸制过程中，在水分和热量的作用下，党参的颜色加深，5-HMF的含量大幅度增加。鉴于5-HMF对人体具有潜在的危害，很有必要对熟党参中5-HMF的含量进行监测。本研究采用 HPLC 法测定不同批次熟党参药材中5-HMF的含量，操作简单快捷，结果准确可靠，测定方法的精密度、重复性、稳定性、回收率良好，可以作为熟党参中5-HMF的测定方法，能够为今后党参的安全性研究提供参考。

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