经典名方清上蠲痛汤的煎煮工艺对其指标成分转移率的影响△

王慧敏，祝倩倩，翟燕娟，王协和，袁健，陆兔林，张科卫*，李松*

1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；

2.江阴天江药业有限公司，江苏 江阴 214400

清上蠲痛汤载于《寿世保元》[1]，明代著名医家龚廷贤之名方，“清上”指清上部的热，“蠲痛”意为祛除疼痛。清上蠲痛汤具有祛风散寒、清热除湿、活血止头痛的功效，其辛而不燥、温而不热、苦而不寒、泄而不降，既可升散风邪，又能苦泄浊阴，适用于各种头痛之证[2]。黄芩中的黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素等黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热镇痛及治疗心血管疾病等作用[3-4]。蔓荆子所含的蔓荆子黄素等黄酮类成分具有止痛、抗菌、消炎作用，对心血管疾病、肿瘤等也显示出一定的疗效[5]。防风中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷等色原酮类化合物具有镇痛和解热作用[6]。甘草中的甘草酸、甘草次酸具有促肾上腺皮质激素的作用，可用于解毒、抗炎、镇咳、抗菌等[7]。

目前，关于清上蠲痛汤的研究多集中于临床应用，仅有1 篇清上蠲痛汤指纹图谱的研究报道[8]，尚未见到有关其冻干粉、工艺方面的文献报道。本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立清上蠲痛汤物质基准（以下简称冻干粉）中黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、蔓荆子黄素和升麻素苷的含量测定方法，计算了各指标成分的转移率，根据出膏率、主要指标成分含量及转移率关键指标对清上蠲痛汤冻干粉的煎煮工艺和锉散粒度进行研究，可为其他煮散剂冻干粉煎煮工艺和锉散粒度的研究提供参考。

1.1 仪器

Acquity 型超高效液相色谱仪、Empower 3 工作站（Waters 公司）；
kQ-250E 型超声清洗机（昆山超声仪器有限公司）；
ME204E 型电子天平、XP6 型百万分之一天平（Mettler-Toledo 公司）；
Milli-Q®IQ 7005型纯水系统（Millipore公司）；
TGL-16C型离心机（上海安亭科学仪器厂）；
YMW 2L 500W 型陶瓷保健壶（深圳市一枚王电子商务有限公司）、DFY-200C 型摇摆式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司，200 g）；
171E（SCRC）型恒温磁力搅拌器（国药集团化学试剂有限公司）；
TRL-0.5 型真空冻干机（大连双瑞科技有限公司）。

1.2 试药

对照品黄芩苷（批号：110715-201821，纯度：95.4%）、汉黄芩苷（批号：112002-201702，纯度：98.5%）、蔓荆子黄素（批号：111554-201705，纯度：98.3%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度：96.2%）、升麻素苷（批号：111522-201712，纯度：96.2%）均购于中国食品药品检定研究院；
甲醇、乙腈、甲酸、磷酸均为色谱纯；
其他试剂均为分析纯。药材及饮片经江阴药业有限公司唐波工程师鉴定均为正品，样品信息见表1。

表1 清上蠲痛汤处方样品信息

2.1 检测样品制备

2.1.1 冻干粉对应实物制备 取日处方药量：酒当归3.73 g、川芎3.73 g、白芷3.73 g、细辛1.12 g、羌活3.73 g、独活3.73 g、防风3.73 g、菊花1.87 g、蔓荆子1.87 g、麸炒苍术3.73 g、酒黄芩5.60 g、麦冬3.73 g、甘草1.12 g，粉碎，加水406 mL（9倍量），浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，200 目筛趁热滤过，残渣加水316 mL（7倍量），煮沸后再煎煮15 min，200 目筛趁热滤过，合并2 次滤液，即得清上蠲痛汤水煎液。放冷后，精密移取清上蠲痛汤水煎液4 mL 至西林瓶中，冷冻干燥72 h，得到清上蠲痛汤冻干粉对应实物样品。

2.1.2 供试品溶液制备 取冻干粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液1。

取冻干粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液2。

2.1.3 对照品溶液制备 取对照品黄芩苷、汉黄芩苷适量，精密称定，加甲醇制成黄芩苷、汉黄芩苷质量浓度分别为1500、350 μg·mL-1的溶液，即得对照品溶液1。

取对照品甘草酸铵、蔓荆子黄素适量，精密称定，加50%甲醇制成甘草酸铵、蔓荆子黄素质量浓度分别为97、10 μg·mL-1的溶液，即得对照品溶液2。

取对照品升麻素苷适量，精密称定，加50%甲醇制成升麻素苷质量浓度为35 μg·mL-1的溶液，即得对照品溶液3。

2.2 有效成分的UPLC定量检测

2.2.1 黄芩苷和汉黄芩苷 取2.1.2 项下制备的供试品溶液1 和2.1.3 项下制备的供试品溶液1，以甲醇-0.2%磷酸溶液（48∶52）为流动相，检测波长为355 nm的色谱条件进行方法学考察。

2.2.2 蔓荆子黄素和甘草酸 取2.1.2 项下制备的供试品溶液2 和2.1.3 项下制备的供试品溶液2，以流动相为甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B）梯度洗脱（0～10 min，57%A；
10～15 min，57%～75%A；
15～16 min，75%～90%A；
16～18 min，90%A），检测波长为254 nm的色谱条件进行方法学考察。

2.2.3 升麻素苷 取2.1.2 项下制备的供试品溶液2 和2.1.3 项下制备的对照品溶液3，以甲醇-乙腈-0.05%甲酸溶液（15∶8∶77）为流动相，检测波长为254 nm的色谱条件进行方法学考察。

2.3 出膏率及有效成分转移率的影响因素考察

2.3.1 提取时间 《寿世保元》中未对本方的加水量、煎煮时间进行明确要求，煎煮方式为水煎服[1]。根据2020 年在北京举行的首届经典名方开发专家共识峰会上的指导意见、国家中医药管理局发布的《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（征求意见稿）》[9]及张星等[10]研究表明，基准样品应根据国家发布的古代经典名方关键信息及古籍记载内容进行制备，若国家发布的古代经典名方关键信息或古籍记载内容中仅为“水煎服”等，对于此类无详细工艺制法表述的方剂，应参照《医疗机构中药煎药室管理规范》[11]并结合具体情况，合理确定制备工艺。

综合以上结果，清上蠲痛汤按照《医疗机构中药煎药室管理规范》煎煮要求[11]，取日处方量饮片粉碎，一煎加水406 mL（9 倍量），二煎加水316 mL（7 倍量）浸泡30 min。含芳香挥发性有效成分的药物煎煮时间则不宜过长，以避免芳香成分丧失，损失药性，降低药效[12]。因方中防风、羌活、白芷、细辛等为解表类中药，而解表类中药的煎煮时间一般规定在20 min左右[13]。故本研究以一煎20 min为基点，考察4种不同的煎煮时间。煎煮后滤液均趁热过200目筛，合并一煎、二煎2次滤液。分别考察一煎30 min、二煎25 min；
一煎25 min、二煎20 min；
一煎20 min、二煎15 min；
一煎15 min、二煎10 min，4种不同煎煮时间的冻干粉的出膏率，黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、蔓荆子黄素和升麻素苷指标成分的转移率。

2.3.2 提取过程加盖与否 本研究在处方量饮片煎煮时，考察了煎煮过程中加盖和不加盖条件下对清上蠲痛汤出膏率和有效成分转移率的影响。按照处方剂量，称取清上蠲痛汤日处方剂量，将每剂复方分别置于各药煎壶中，一种方式全程加盖，另一种方式全程不加盖，加水406 mL浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，滤液趁热过200 目筛，残渣加水316 mL 煮沸后再煎煮15 min，趁热过200目筛，合并2次滤液，即得清上蠲痛汤的加盖和不加盖的水煎液。分别考察冻干粉的出膏率，黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、蔓荆子黄素和升麻素苷指标成分的转移率。

2.3.3 粒度 饮片制备成粗颗粒不仅可以节省饮片、增大饮片与溶剂的接触面积，还可减少煎煮时间、增加有效成分的溶出[14]。但有时粒度过细并不一定利于有效成分的煎出。使用铜舂和粉碎机对饮片进行锉散处理，得到不同粒径大小的饮片颗粒。按日剂处方量分别称取13 味饮片锉碎，依次过4 目筛、10 目筛和24 目筛，得到3 种不同粒度的颗粒，按2.1.1 项下方法制得冻干粉。分别考察其冻干粉的出膏率，黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、蔓荆子黄素和升麻素苷等指标成分的转移率。

3.1 指标成分的UPLC图谱

清上蠲痛汤中黄芩苷、汉黄芩苷、蔓荆子黄素、甘草酸和升麻素苷的含量色谱图见图1～3。

图1 清上蠲痛汤及黄芩苷、汉黄芩苷色谱图

3.2 UPLC色谱条件

3.2.1 黄芩苷、汉黄芩苷 安捷伦ZORBAX Eclispse Plus C18RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；
以甲醇-0.2%磷酸溶液（48∶52）为流动相；
流速为0.3 mL·min-1；
柱温为30 ℃；
检测波长为355 nm；
进样体积为1 μL。

图2 清上蠲痛汤及蔓荆子黄素、甘草酸色谱图

图3 清上蠲痛汤及升麻素苷色谱图

3.2.2 蔓荆子黄素、甘草酸 安捷伦ZORBAX Eclispse Plus C18RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；
流动相为甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，57%A；
10～15 min，57%～75%A；
15～16 min，75%～90%A；
16～18 min，90%A）；
流速为0.3 mL·min-1；
柱温为30 ℃；
检测波长为254 nm；
进样体积1 μL。

3.2.3 升麻素苷 安捷伦ZORBAX BONUS RP RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；
以甲醇-乙腈-0.05%甲酸溶液（15∶8∶77）为流动相；
流速为0.25 mL·min-1；
柱温为30 ℃；
检测波长为254 nm；
进样体积1 μL。

3.3 UPLC方法学验证

方法学考察结果显示，清上蠲痛汤中5个指标成分的含量测定方法仪器精密度、线性、重复性、稳定性均良好，加样回收率均在规定范围内，结果见表2。

3.4 有效成分的转移率及其影响因素

3.4.1 提取时间 测定4 种煎煮时间下清上蠲痛汤中黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、蔓荆子黄素和升麻素苷的转移率及冻干粉的出膏率（表3）。按公式（1）计算转移率。

表3 不同煎煮时间清上蠲痛汤中5个主要指标成分的转移率及出膏率 %

由表2 可知，不同的煎煮时间黄芩苷转移率几乎没有差异，表明煎煮时间对黄芩苷的转移率没有较大影响；
煎煮时间越长汉黄芩苷的转移率越高；
随着煎煮时间缩短，甘草酸和蔓荆子黄素的转移率略有升高；
一煎25 min，二煎20 min 升麻素苷的转移率最高。结果表明不同煎煮时间条件下出膏率差别不大。综合以上的结果，最终选择一煎20 min，二煎15 min作为煎煮时间。

表2 清上蠲痛汤中5个指标成分含量测定方法学考察

煎煮时间过久，防风有效成分含量降低，可能是因为煎煮时间对中药某些成分的含量具有一定的影响，在煮药的过程中，随着煎煮时间的不同，单味药的各组分之间也可能产生复杂的化学反应，这些反应最终影响中药中某些成分的含量[12]。煎煮中药的过程是中药有效成分不断向溶液释放、溶解的过程，当药液中有效成分溶解到一定质量浓度后，溶解和析出过程达到平衡，就不会再释放有效成分，再继续煎，不仅不会使药物内的有效成分继续溶解，反而会使药液中的有效成分不断蒸发而减少，甚至使有效成分在长时间的高温中遭到破坏，导致药效降低[15-16]。复方中有效成分含量复杂，一个时间点不能保证所有药物的有效成分均被煎出且不被破坏[17]。综合考虑整个复方药味的特点及指标成分的转移率等因素，确定最佳煎煮时间。

3.4.2 提取过程加盖与否 测定加盖和不加盖条件下煎煮出的清上蠲痛汤中黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、蔓荆子黄素和升麻素苷的转移率及冻干粉的出膏率，结果见表4。

表4 加盖与否清上蠲痛汤中主要指标成分的转移率及出膏率 %

由表4 可知，加盖煎煮时各指标成分的转移率均高于不加盖，因为方中所含的蔓荆子黄素和升麻素苷含量较低，所以对蔓荆子黄素和升麻素苷的转移率影响较大。黄芩苷、汉黄芩苷和甘草酸因含量较高，含量较稳定，所以转移率的增长幅度不大，在5%左右。蔓荆子黄素转移率增长幅度为40%，升麻素苷转移率增长幅度为16%。增长幅度较大，推测蔓荆子黄素和升麻素苷在不加盖煎煮时，可能加大了与空气中的氧气反应，转化成具有挥发性的物质，或者与其他物质发生反应，一部分转化为其他物质。加盖煎煮时的平均出膏率略高于不加盖煎煮。

如果煎中药不加盖，中药内的有效成分便易随水蒸气“跑”出去，降低药物疗效。有些药物的有效成分为挥发油，大多挥发油比水轻，开盖煎煮，挥发油随水蒸气一起蒸出[14]。综合以上结果，此方需加盖煎煮。

3.4.3 粒度 不同粒度煎煮，清上蠲痛汤中指标成分的转移率及出膏率结果见表5。

表5 不同锉散粒度清上蠲痛汤中主要指标成分的转移率及出膏率 %

结果显示，黄芩苷和汉黄芩苷的转移率在饮片粒度过24目筛时明显低于其他2种锉散粒度；
饮片过24目煎煮时的甘草酸和蔓荆子黄素的转移率明显偏高；
锉散粒度对升麻素苷的转移率未有明显影响。24目的出膏率也微高于其他2种粒度。随着饮片粒径的减小，甘草颗粒的比表面积增大，吸附作用增强，被吸附的甘草酸分子增多；
而扩散作用也会增强，甘草酸分子溶出的也越多[7]。当粒度减小，由于扩散作用不起主导作用，表面能的作用加强，黄芩苷分子越容易吸附在黄芩颗粒表面，较难溶解出来，黄芩苷的溶出量也就越低[18]。

甘草日剂量为1.12 g，在全方中占比仅为2.48%，比较清上蠲痛汤水煎液中甘草对应固形物含量，饮片过4 目筛0.090%，过10 目筛0.092%，过24 目筛0.117%，3 种锉散粒度对于汤剂中甘草对应固形物含量的影响不是很大。甘草缓急止痛、调和诸药[19]，为本方中使药。蔓荆子日剂量为1.87 g，在全方中占比为4.14%，比较清上蠲痛汤水煎液中蔓荆子对应固形物质量分数，饮片过4 目筛和10 目均为0.011%，24 目为0.113%，3 种锉散粒度对于汤剂中蔓荆子对应固形物含量几乎没有影响。比较滤过后的不同锉散粒度的水煎液，饮片过4 目筛时水煎液清澈，另2 种水煎液浑浊，且24 目筛煎出液在滤过时极为困难。

虽然饮片经过粉碎可提高某些有效成分的溶出，但也可能会增加其他一些未知成分的溶出。清上蠲痛汤13 味药中有8 味药是质地坚硬或纤维性强的根及根茎类药材，这类药材不易粉碎，若要进行煮散，粉碎粒度会受限，为方便操作，有必要在保证质量的前提下适当放大粉碎粒度[20]。同时考虑到生产的可行性，最终确定饮片的锉散粒度为全部过4 目筛，但混有通过10目筛的不超过20%。

研究结果表明，不同的煎煮时间对各成分的煎出率具有较为明显的影响。在确定本方煎煮时间时，不仅要考虑到某些成分的转移率，还要考虑方中较多药味为清热类和芳香类中药，不宜久煎。在煎煮过程中进行加盖，从而降低有效成分随水蒸气的蒸发而减少的影响，以保证药物疗效。本研究前期通过查阅文献、论坛讨论等多种途径，选择将饮片粉碎成过4 目筛、10 目筛和24 目筛。结果表明除升麻素苷外，不同的锉散粒度对其他指标成分的转移率有较为明显的影响，随着饮片粉碎粒度的减小，煎出率提高，出膏率随之增大。经典名方的最终研究归于制剂生产，考虑到后续大生产的煎煮设备，避免造成煎煮时设备堵塞等不必要的影响，选择粉碎粒度较高的过4 目筛作为锉散粒度。因方中大多数中药中含有挥发油，在后期小试实验中能否收集到挥发油还需进一步实验研究。

在实验过程中，取样不均等各方面因素对各指标成分的转移率均有影响，在后期实验中，对于饮片的选择应尽量保持统一的规格，减少因取样带来的误差；
尽量保持药煎壶功率一致，降低因实验仪器带来的误差。

本研究从指标成分含量和出膏率等多方面考察，对冻干粉的煎煮时间、加盖与否和锉散粒度等工艺参数进行研究和确定。本研究仅为实验室实验，后期的工业化生产还需参考本研究的参数进行小试、中试等研究。对于冻干粉后续开发研究，还需全面考察药材-饮片-中间体-对应实物的相关性，并对对应实物制备过程中关键质量属性的量值传递关系进行深入研究。